高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中維生素C含量的FAPAS能力驗證結果與分析

◎ 劉 靜，馬殿君，董 斌，施 法

（1.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110036；2.大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116021；3.沈陽食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136）

維生素C又名抗壞血酸，具有很強的抗氧化性，可參與膠原蛋白和類固醇的合成、鐵的吸收等多種生物化學反應[1]，具有預防動脈硬化、提高免疫力、治療壞血病、預防衰老、減輕炎性反應、防癌抗癌等作用[2-5]，是維護人體正常生理機能所必需的水溶性維生素。人體自身無法合成和儲存維生素C，必須從外界獲得[6]，在嬰幼兒配方乳粉中，維生素C是重要的必需營養素[7]，國家標準《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）對其指標含量作了相應的規定。維生素C烯醇式己糖酸內酯結構不穩定，其結構式見圖1，遇水、光、熱、氧都易發生降解[8]，所以快速準確檢測產品中的維生素C對產品質量檢測具有重要意義。

圖1 維生素C的化學結構式圖

目前，維生素C的檢測方法主要有滴定法[9]、伏安法[10]、分光光度法[11-13]、紅外光譜法[14]、高效液相色譜法[15-18]和液相色譜串聯質譜法[19]等。滴定法、伏安法和分光光度法操作過程復雜，所需時間長，而且專屬性不強，易受外界因素的干擾；紅外光譜法建模需要大量的樣品和較長的周期，準確度較差[20]；液相色譜串聯質譜法對儀器和人員的水平要求較高，不太具有普遍適用性。高效液相色譜法具有高效、高靈敏度、重復性好等優點，廣泛用于產品的含量測定中，也是各國藥典和國家標準中收錄的常規方法。針對乳粉中維生素C的測定，我國現行的相關檢測標準為《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》（GB 5009.86—2016）和《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素C的測定》（GB 5413.18—2010）。GB 5009.86—2016的第二法和 GB 5413.18—2010采用的是熒光分光光度法，該方法前處理步驟復雜，干擾因素較多，方法的重復性也不理想。本研究在GB 5009.86—2016第一法 高效液相色譜法的基礎上進行了優化，改進色譜系統，簡化前處理步驟，使其更適用于嬰幼兒乳粉中維生素C的質量控制。

為確保維生素C檢測結果的準確可靠，定期參加外部質量控制尤為必要，能力驗證作為重要的外部質量評價活動，是實驗室用于質量監控的重要手段之一。目前，具備能力驗證資格的機構主要有中國合格評定國家認可委員會（CNAS）、英國分析實驗能力驗證公司（FAPAS）和英國分析化學標準實驗室（LGC）等[21]，其中，FAPAS分析實驗能力驗證是專門從事食品檢驗方面的能力評價體系，通過比對實驗室間的測試結果來判定實驗室的能力[22]。為提高乳粉相關檢測能力和水平，本實驗室參加了2020年度FAPAS嬰幼兒配方乳粉中維生素C含量檢測的能力驗證，通過參加能力驗證活動，不僅可以驗證方法的可行性和人員的檢驗水平，而且有助于發現實驗室在管理或技術能力方面存在的問題，并及時加以整改和完善，以持續提高實驗室的檢測水平和質控能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）、磷酸二氫銨（分析純）、磷酸（分析純）和偏磷酸（分析純）（國藥集團有限公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。維生素C對照品（L（+）-抗壞血酸）（純度100%，購自中國食品藥品檢定研究院）。實驗樣品為FAPAS組織方提供的嬰兒配方乳粉，乳白色粉末，樣品編號為21120。質控樣品購自FAPAS組織方，編號為21115。

1.2 儀器與設備

Alliance acquity e2695 HPLC系統，包括四元高壓梯度泵、自動進樣器、2998二極管陣列檢測器以及Empower 色譜工作站（美國Waters公司）；XP 205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；AS系列超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MODEL868酸度計（Thermo公司）；Mili-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

采用TechMate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨水溶液（用磷酸調節pH值至2.0）（2∶98，V∶V）等度洗脫；檢測波長：245 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.7 mL·min-1；進樣量：20 μL。

1.3.2 溶液配制

對照品儲備溶液（1.103 mg·mL-1）配制：精密稱取維生素C對照品22.06 mg，置20 mL棕色容量瓶中，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）溶解并定容至刻度，搖勻，得對照品儲備溶液。

對照品使用溶液（110.3 μg·mL-1）配制：精密量取5 mL對照品儲備溶液，置50 mL棕色容量瓶中，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋定容至刻度，搖勻，得對照品使用溶液。

標準系列工作液配制：分別精密量取對照品使用溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL和8.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋至刻度，搖勻，標準系列溶液濃度分 別為 5.52 μg·mL-1、11.03 μg·mL-1、22.06 μg·mL-1、44.12 μg·mL-1、66.18 μg·mL-1和 88.24 μg·mL-1。

供試品溶液配制：準確稱取混勻后的樣品粉末2 g，置于50 mL棕色容量瓶中，加適量偏磷酸溶液（20 g·L-1），振搖溶散后超聲提取20 min，放冷，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm水系濾膜后進行液相分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

維生素C極性較大，在反相色譜柱上不易保留，GB 5009.86—2016的第一法采用離子對試劑與待測物結合的方式使其保留。離子對試劑對色譜柱的傷害較大，且分析需要較長的平衡時間，如果平衡時間不足會導致測得結果的重復性不符合要求。本實驗嘗試多種緩沖鹽體系后，最終選擇磷酸二氫銨水溶液-甲醇作為流動相系統，由于維生素C為酸性化合物，為了增強其保留效果，緩沖液體系用磷酸調節pH值至2.0。該流動相系統酸性較強，水相比例較大，對色譜柱的要求較高。試驗考察了資生堂CAPCELL-PAK C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm） 和 TechMate C4ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）4種不同色譜柱的分離效果和耐用性。結果顯示，維生素C在C4色譜柱上的保留較差，且主峰與雜質峰分不開，影響維生素C的分析測定；資生堂CAPCELL-PAK C18和Eclipse XDB-C18色譜柱可以耐受低pH的流動相體系，維生素C的峰形和分離尚可，但在進行多個分析批的測定時，會出現色譜峰峰形變差和保留時間不穩定的現象，這可能是由于高比例的水相體系造成色譜柱疏水塌陷，從而影響分離效果；TechMate C18-ST是一種耐寬pH范圍和高比例水相的色譜柱，適用于本研究采用的流動相體系，該色譜柱不僅可以實現主峰與雜質峰的完全分離，在連續進行多個分析批的檢測時，穩定性和耐用性均能符合實驗要求，故實驗最終采用TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進行維生素C的分析測定。

2.2 提取溶劑的選擇

維生素C容易失去電子，具有還原性，是一種較強的還原劑，在水溶液中，尤其是堿性溶液中很容易被氧化，水溶液呈酸性時可抑制降解[23]。通過參考文獻及國標中采用的提取溶劑，本實驗考察了草酸溶液、磷酸水溶液及偏磷酸水溶液為提取溶劑時對維生素C提取效率及峰形的影響。結果顯示，磷酸水溶液和偏磷酸水溶液提取維生素C的峰形優于草酸作為提取溶劑時的峰形，但磷酸水溶液的濃度達到8%時提取回收率才達到滿意結果，考慮高濃度酸對分析儀器的損傷，實驗最終選擇偏磷酸溶液作為提取溶劑，維生素C的峰形較理想，回收率符合要求。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性及系統適應性試驗

維生素C有兩種構型，分別為L（+）-抗壞血酸和D（-）抗壞血酸，在該實驗條件下，二者可以達到基線分離，分離度為1.97，色譜圖見圖2。由于樣品中只檢測到了L（+）-抗壞血酸，故實驗將測得的L（+）-抗壞血酸的含量作為維生素C的含量。對照品溶液和供試品溶液的液相色譜圖中維生素C的理論塔板數分別為12 256和10 443，峰形對稱，供試品溶液中維生素C峰與其他雜質峰分離較好，空白溶劑不干擾樣品測定，該方法專屬性良好。空白溶劑色譜圖、對照品溶液及樣品溶液色譜圖見圖3。

圖2 L（+）-抗壞血酸和D（-）抗壞血酸的HPLC色譜圖

圖3 空白、對照品和樣品溶液的HPLC色譜圖

2.3.2 線性關系考察

取標準系列工作液，按照“1.3.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖。以維生素C濃度C（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行回歸，繪制標準曲線，維生素C的回歸方程為：A=104 076.11C-6 207.98（r=0.999 7，n=6），結果表明，維生素C在5.52～88.24 μg·mL-1，濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取維生素C對照品溶液20 μL，按“1.3.1”項下色譜條件測定，重復進樣6次，維生素C色譜峰保留時間和峰面積的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為0.52%（n=6）和0.43%（n=6）。結果表明，儀器的精密度良好。

2.3.4 重復性試驗

精密稱取同一樣品6份，按照“1.3.2”項下同法制備供試品溶液，采用“1.3.1”項下色譜條件測定，按外標法計算維生素C的含量。樣品中維生素C的平均含量為88.0 mg/100 g，RSD為1.16%。結果表明，重復性良好。

2.3.5 加標回收試驗

精密量取已知含量的樣品1 g，分別加入“1.3.2”項下所配制的對照品儲備溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL，每份樣品平行操作3份，按“1.3.2”項下同法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件測定，采用標準曲線法定量，計算平均回收率及相對標準偏差（n=9），結果如表1所示。其平均回收率在97.50%～101.38%，相對標準偏差（RSD）在0.91%～1.66%，說明本實驗使用的方法可靠，準確度符合實驗要求。

表1 維生素C的回收率及其RSD結果表（n=9）

2.3.6 穩定性試驗

取供試品溶液，按照“1.3.1”項下色譜條件進行HPLC測定，分別于0 h、2 h、4 h、8 h和10 h進樣，記錄維生素C色譜峰面積。結果顯示，維生素C的峰面積RSD為1.22%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.4 樣品含量測定結果及判定

為減小實驗誤差，保證數據結果的準確性，實驗過程采用人員比對和質控樣品實驗。每份樣品均采用雙人三平行，采用外標法定量，維生素C測定結果見表2。

表2 質控樣品和能力驗證樣品含量測定結果及判定表

由表2可知，人員比對結果的相對標準偏差范圍為0.25%～0.95%，偏差較小，說明實驗結果受人員差異的影響較小，由外部帶入的誤差在可控范圍內。平行實驗結果的RSD均為1.16%，滿足實驗要求。本次能力驗證的分析評價方式采取的是Z比分數進行確定。|Z|≤2為滿意；|Z|≥3為不滿意，應采取糾正措施；2＜|Z|＜3為可疑，提示應引起警戒[24]。由本次能力驗證結果可知，質控樣品21115的測定值在參考值范圍內，Z值為-0.3，說明該實驗方法適用于嬰幼兒乳粉中維生素C的測定。采用該法測得的能力驗證樣品中維生素C的結果Z值為-0.1，|Z|值＜2且接近0，實驗結果為滿意。

根據FAPAS公布的此次嬰幼兒乳粉中維生素C能力驗證的結果，全球共80家實驗室參與此次實驗室能力驗證比對，73家實驗室的數據|Z|≤2，結果判定為滿意，共有7家實驗數據|Z|＞2，結果判定為不滿意，滿意率達到91%。本實驗室參加能力驗證的實驗數據|Z|值為0.1，結果非常接近中位值，說明利用該方法檢測乳粉中維生素C是準確可靠的。實驗過程中有2個關鍵點。①由于維生素C不穩定，應當嚴格按照作業指導書的儲藏條件存放，開封后應立即檢測。②實驗設置人員平行實驗和質控實驗，并設置了空白對照，排除試劑污染和人員誤差，保證檢測結果的準確。通過此次能力驗證考核，驗證了優化后的檢驗方法的適用性和準確性，積累了乳粉檢測的相關經驗，提高了實驗人員分析問題、解決問題的能力和實驗室質量控制的信心。

3 結論

本研究根據維生素C的特點和乳粉檢測的需要，建立了一種快速分離分析嬰幼兒乳粉中維生素C的高效液相色譜法。該方法與國標方法相比，維生素C的同分異構體分離更完全，分析時間更短；由于改進了流動相體系，使得重復性更好；采用該法測定能力驗證樣品中的維生素C，|Z|為0.1，判定結果為滿意，表明該法可以用于嬰幼兒乳粉中維生素C的質量檢測。該法不僅可以用于嬰幼兒乳粉中維生素C的含量測定，也可為食品和保健食品中維生素C的質量控制提供參考。