超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠及氯霉素殘留量的方法驗(yàn)證

◎ 母昌立，王 蓓，遲志娟，王 姣，周益政，王淳純，劉培培

（1.江蘇省太倉(cāng)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 太倉(cāng) 215412；2.北京六角體科技發(fā)展有限公司，北京 101102）

在《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號(hào)）中明令禁止孔雀石綠、硝基呋喃類、氯霉素等3類6種藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，在動(dòng)物性食品中不得檢出。為此，國(guó)家相關(guān)部門出臺(tái)了相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。除了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法之外，針對(duì)3類6種藥物的殘留檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也相繼報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附法[4]、色譜法[5]、質(zhì)譜法[6-9]。

綜合上述檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道，沒有3類6種藥物同時(shí)前處理進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道，因此，本文驗(yàn)證了北京六角體科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒在本實(shí)驗(yàn)室的適用性。此次驗(yàn)證包括產(chǎn)品適用范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)精密度及方法回收率。

1 材料與方法

1.1 材料

本方法以鯽魚、河蝦和河蟹為試驗(yàn)材料，驗(yàn)證該產(chǎn)品是否滿足本實(shí)驗(yàn)室的要求。

1.2 試劑與耗材

水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒（包含檢測(cè)試劑A、檢測(cè)試劑B和固相萃取柱），北京六角體科技發(fā)展有限公司；呋喃唑酮代謝物（AOZ）、阜南他酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（AHD）和呋喃妥因代謝物（SEM）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)溶液、孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-13C15N2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D5混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，以上標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司；乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純、乙腈（色譜純、正己烷（色譜純）和甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher公司；GHP微孔濾器（0.22 μm），美國(guó)Waters公司；魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

5500型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB公司；3-18K高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；恒溫水浴鍋（DK-600）：上海冉繪實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 前處理方法

取絞碎的試料4.0 g置離心管中，加100 ng·mL-1的氯霉素 -D5標(biāo)準(zhǔn)工作液，AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-(1，2-15N2，13C)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D6混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μL，再加4.0 mL檢測(cè)試劑A，1.0 mL衍生化試劑，充分混勻后，65 ℃超聲提取20 min，其間搖勻2～3次。超聲后加入2.5 mL檢測(cè)試劑B，振蕩混勻，加入一管提取劑1、5.0 mL提取劑2，振蕩10 min，8 000 r·min-1離心5 min。

用5.0 mL提取劑2活化固相萃取柱，取3.0 mL上清液過活化后的固相萃取柱，并擠干柱體，用離心管接流出液，備用。用2.0 mL乙腈+0.5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（75+25，v/v）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，渦旋混勻后備用。

硝基呋喃類代謝物、氯霉素待測(cè)液：取1.0 mL洗脫液添加到流出液中，50 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL水復(fù)溶，再用1.0 mL正己烷去除油脂，下層即為硝基呋喃類代謝物和氯霉素的待測(cè)液，經(jīng)0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

孔雀石綠待測(cè)液：剩余洗脫液即為孔雀石綠待測(cè)液，經(jīng)0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 硝基呋喃類代謝物檢測(cè)方法

硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)參照母昌立等[9]的方法。

1.5.2 氯霉素檢測(cè)方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動(dòng)相：水（A）+甲醇（B）=60+40；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，負(fù)離子；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監(jiān)測(cè)離子對(duì)及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5.3 孔雀石綠檢測(cè)方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動(dòng)相：乙腈 +5 mmol·L-1乙酸銨 =75+25；0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，正離子；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監(jiān)測(cè)離子對(duì)及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯霉素、孔雀石綠及其同位素標(biāo)記物的主要質(zhì)譜參數(shù)表

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.6.1 硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密量取適量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于不同離心管中。按1.4處理，制得0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.1方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定2次。

1.6.2 氯霉素和孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別精密量取適量的100 ng·mL-1的氯霉素和孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL容量瓶中，加入100 ng·mL-1的對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液250 μL，用流動(dòng)相定容，制得 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.2和1.5.3進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定2次。

1.7 靈敏度的驗(yàn)證

在對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中，硝基呋喃類代謝物在動(dòng)物源食品中的檢測(cè)限為 0.25 ng·g-1，定量限為 0.50 ng·g-1[1]，氯霉素在動(dòng)物源食品中的檢測(cè)限為0.1 ng·g-1，定量限為0.2 ng·g-1[3]，孔雀石綠和隱色孔雀石綠動(dòng)物源食品中的檢測(cè)限為0.5 ng·g-1[2]。在每種樣品中加入適量的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各化合物在樣品中的濃度分別為檢測(cè)限和定量限，重復(fù)10次，按照1.4進(jìn)行前處理，1.5進(jìn)行檢測(cè)。若濃度為檢測(cè)限時(shí)，信噪比≥3，則檢測(cè)限滿足要求；若濃度為定量限時(shí)，信噪比≥10，則定量限滿足要求[10]。

1.8 精密度的驗(yàn)證

《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號(hào)）規(guī)定，硝基呋喃類代謝物、氯霉素和孔雀石綠均為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中均不得檢出。因此，在添加濃度為檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限3個(gè)濃度[11]，每種樣品每個(gè)濃度重復(fù)10次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.9 回收率的驗(yàn)證

在每種樣品中加入適量的待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限濃度，每種樣品每個(gè)濃度重復(fù)10次，按照1.4進(jìn)行前處理，1.5進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度目標(biāo)物峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)（見表2）。由表2看出，各待測(cè)物線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，相關(guān)性良好，可用于準(zhǔn)確定量[11]。

表2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG的線性方程及相關(guān)系數(shù)表

2.2 靈敏度

在每種樣品中加入適量的待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測(cè)限和定量限濃度，重復(fù)10次。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)待測(cè)物濃度為檢測(cè)限濃度時(shí)，信噪比均＞3；待測(cè)物濃度為定量限濃度時(shí)，信噪比均＞10。由此可見，本產(chǎn)品的方法檢測(cè)限和定量限均滿足實(shí)驗(yàn)室的要求。

2.3 精密度和回收率

每種樣品在檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限3個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)10次，檢測(cè)后得到表3所示結(jié)果。由表3可以看出，6種化合物在鯽魚、河蝦和河蟹中添加回收率均在60%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜30%，滿足各對(duì)應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG在鯽魚、河蝦和河蟹的精密度和添加回收率表

2.4 質(zhì)控樣測(cè)定

利用1.4的前處理方法處理魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣，利用1.5.3的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與質(zhì)控樣證書相符。

3 結(jié)論

經(jīng)過驗(yàn)證，北京六角體科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒的適用范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)精密度及方法回收率均滿足要求。本實(shí)驗(yàn)室利用此產(chǎn)品對(duì)購(gòu)自大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司的魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果滿意。