食品中金黃色葡萄球菌定量檢測的不確定度評定

◎ 魏 敏，姜華軍

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 威海 264210）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于自然界中，人和動物是其主要攜帶者，通常寄生于人和動物的皮膚表面及鼻腔、咽喉等上呼吸道黏膜，也存在于空氣、水、土壤等環(huán)境中[1]。金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病微生物，其在適當(dāng)?shù)臈l件下能產(chǎn)生腸毒素，是引起食物中毒的主要原因[2-3]。金黃色葡萄球菌感染是世界性衛(wèi)生難題，在美國等西方國家，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的1/3，我國每年也有此類中毒事件發(fā)生[4]。

金黃色葡萄球菌污染的食品主要有乳制品、蛋制品及各類熟肉制品等[5]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）中規(guī)定了乳制品、肉制品等8大類食品中金黃色葡萄球菌的限量要求[6]。目前，對金黃色葡萄球菌的定量檢測主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)中的平板計數(shù)法。本文建立金黃色葡萄球菌定量檢測的不確定度評定方法，分析確定影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，并在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行針對性的控制，提高檢測結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌種（CICC 21600，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；磷酸鹽緩沖液、Baird-Parker瓊脂、凍干血漿、腦心浸出液肉湯和血瓊脂平板（北京路橋技術(shù)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PRACTUM1102-1CN電子天平（德國Sartorius公司）；Bagmixer 400SW拍擊式均質(zhì)器（法國Interscience公司）；KB115培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；AB2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；GE60DF立式壓力蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）。

1.3 方法

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）第二法金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)程序見圖1[7]。稱取25 g經(jīng)檢測為金黃色葡萄球菌陰性的乳粉樣品，置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的均質(zhì)袋中，加入20 μL麥?zhǔn)蠞岫葹?.5 MCF的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌種菌懸液，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，制成1∶10樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 mL，注入盛有9 mL磷酸鹽稀釋液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100樣品勻液。按上述操作步驟，制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換1次1 mL無菌吸管。選擇2個適宜稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取樣品勻液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種至3塊Baird-Parker平板，涂布均勻后于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。選取同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20～200 CFU的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)，并進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)，報告結(jié)果。

圖1 金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法 檢驗(yàn)程序圖

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

數(shù)學(xué)模型如下：

式中：T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)，CFU·g-1；A為某一稀釋度典型菌落的總數(shù)，CFU·g-1；B為某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù)，CFU·g-1；C為某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù)，CFU·g-1；d為稀釋因子。

2.2 不確定度分量的主要來源

通過對實(shí)際檢測過程和數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，不確定度的主要來源有5個方面。①樣品稱量過程引入的不確定度。②樣品定容過程引入的不確定度。③逐級稀釋過程引入的不確定度。④接種Baird-Parker平板時引入的不確定度。⑤重復(fù)檢測引入的不確定度。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 樣品稱量過程引入的不確定度評定

本實(shí)驗(yàn)用感量為0.01 g的電子天平稱取25.00 g樣品，重復(fù)稱量10次，樣品質(zhì)量均為25.00 g，因此不考慮稱量重復(fù)性引入的不確定度。樣品稱量引入的不確定度主要有2個來源，分別是天平校準(zhǔn)和可讀性（分辨力）引入的不確定度。①校準(zhǔn)。根據(jù)天平的檢定證書和《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）[8]，感量為0.01 g的電子天平在0～500 g最大允許誤差為±0.05 g，區(qū)間半寬度為0.05 g，按矩形分布，天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為②可讀性。天平的分辨力為0.01 g，區(qū)間半寬度為0.005 g，按矩形分布，天平可讀性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因此，樣品稱量過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(稱量)=

2.3.2 樣品定容過程引入的不確定度評定

本實(shí)驗(yàn)用250 mL量筒量取225 mL無菌磷酸鹽緩沖液加入到均質(zhì)袋中，制備1∶10樣品勻液，定容過程引入的不確定度包括量筒校準(zhǔn)引入的不確定度、溫度引入的不確定度。①校準(zhǔn)。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[9]，250 mL量出式量筒在20 ℃時的容量允差為±2.0 mL，按矩形分布，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為②溫度?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳈z定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定的是量筒在20 ℃時的容量允差，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為（20±2）℃，偏差為±2 ℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，因此溫度偏差產(chǎn)生的溶液體積變化為±（225×2×2.1×10-4）=±0.094 5 mL，按矩形分布，溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，樣品定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 逐級稀釋過程引入的不確定度評定

（1）吸取樣品勻液時1 mL吸量管引入的不確定度。本實(shí)驗(yàn)逐級稀釋過程采用1 mL吸量管吸取1 mL樣品勻液，其引入的不確定度包括校準(zhǔn)和溫度2個方面。①校準(zhǔn)?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳈z定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定，20 ℃時1 mL流出式分度吸量管（A級）的容量允差為±0.008 mL，按矩形分布，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為②溫度。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度偏差產(chǎn)生的溶液體積變化為±（1×2×2.1×10-4）=±4.2×10-4mL，按矩形分布，溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因此，1 mL吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）吸取稀釋液時10 mL吸量管引入的不確定度。本實(shí)驗(yàn)逐級稀釋過程采用10 mL吸量管吸取9 mL磷酸鹽稀釋液，其引入的不確定度包括校準(zhǔn)和溫度2個方面。①校準(zhǔn)。《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG 196—2006規(guī)定，20 ℃時10 mL流出式分度吸量管（A級）的容量允差為±0.05 mL，按矩形分布，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為②溫度。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度偏差產(chǎn)生的溶液體積變化為±（9×2×2.1×10-4）=±0.003 78 mL，按矩形分布，溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，10 mL吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）逐級稀釋過程的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。進(jìn)行1次逐級稀釋使用1次1 mL和10 mL吸量管，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為由 于10倍 系列稀釋方法相同，故整個稀釋過程的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10倍系列稀釋的次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)最終采用的是1∶1 000稀釋度的平板進(jìn)行菌落計數(shù)，因此進(jìn)行了2次10倍系列稀釋，q=2，逐級稀釋過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（4）接種Baird-Parker平板時引入的不確定度評定。接種過程使用1 mL吸量管吸取1 mL樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板。其引入的不確定度包括校準(zhǔn)和溫度2個方面，計算方法同2.3.3中（1），則接種0.3 mL和0.4 mL樣品勻液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

因此，接種Baird-Parker平板時引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（5）重復(fù)檢測引入的不確定度評定。在相同條件下對同一樣品重復(fù)測10次，由于金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果的發(fā)散性比較大，直接按貝塞爾公式計算樣本標(biāo)準(zhǔn)差不合理，因此本研究將檢測結(jié)果轉(zhuǎn)換為對數(shù)值后進(jìn)行計算，檢測結(jié)果見表1[10-12]。

表1 乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測結(jié)果表

采用貝塞爾公式法計算重復(fù)檢測引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各不確定分量是相互獨(dú)立的，計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 計算擴(kuò)展不確定度

根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[13]，取置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得包含因子k=2.26，故擴(kuò)展不確定度為U=k×uc(T)=2.26×0.029 31=0.066 2。

2.6 結(jié)果報告

樣品中金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果的對數(shù)值lgX=4.592 2±0.066 2，k=2.26。取反對數(shù)后得到金黃色葡萄球菌定量檢測結(jié)果的取值為33 574～45 541 CFU·g-1，修約后為34 000～46 000 CFU·g-1。

3 結(jié)論與討論

本研究按照GB 4789.10—2016平板計數(shù)法對人工染菌的乳粉樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的定量檢測，并對檢測過程中的不確定度進(jìn)行分析和評定，不確定度來源主要有樣品稱量、樣品定容、逐級稀釋、接種及重復(fù)檢測引入的不確定度。由于本實(shí)驗(yàn)采用添加陽性菌株制備人工染菌樣品，鑒定為陽性的菌落數(shù)與用于鑒定實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)的比值（即B/C）均為1，因此未考慮鑒定實(shí)驗(yàn)引入的不確定度。根據(jù)各不確定度分量的評定結(jié)果，接種Baird-Parker平板引入的不確定度貢獻(xiàn)最大，其次是重復(fù)檢測引入的不確定度。重復(fù)性檢測引入的不確定度主要受操作人員、檢測環(huán)境、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌落計數(shù)和樣品均勻性等因素的影響，屬于A類不確定度，可用統(tǒng)計分析的方法進(jìn)行評定，本研究采用了貝塞爾公式法進(jìn)行評定[14]。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)測量不確定度的評定結(jié)果，從人員、儀器設(shè)備、培養(yǎng)基和試劑、檢驗(yàn)方法和環(huán)境條件等方面加強(qiáng)控制，最大限度降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

通過對金黃色葡萄球菌檢測不確定度的評定，分析和評價影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，可為實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險管理和質(zhì)量控制提供指導(dǎo)，有效提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理水平。當(dāng)檢測結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)限量值附近時，結(jié)合測量不確定度判定產(chǎn)品是否合格更科學(xué)和準(zhǔn)確[15]。