機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣誘發(fā)大鼠慢性阻塞性肺疾病并上調(diào)氣道上皮細(xì)胞COX-2/PGE2/EP受體信號(hào)通路*

李德富， 陳建安， 袁良， 張嘉欣， 葉園園， 易高△

·論著·

機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣誘發(fā)大鼠慢性阻塞性肺疾病并上調(diào)氣道上皮細(xì)胞COX-2/PGE2/EP受體信號(hào)通路*

李德富1， 陳建安1， 袁良2， 張嘉欣1， 葉園園1， 易高1△

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510700；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510120）

探究機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣（MVE）長(zhǎng)期暴露引起大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）發(fā)生時(shí)，氣道上皮細(xì)胞中環(huán)加氧酶2（COX-2）/前列腺素E2（PGE2）/E-前列腺素類(lèi)激素（EP）受體信號(hào)通路成員的表達(dá)變化。（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：健康雄性SD純系大鼠（SPF級(jí)）16只，隨機(jī)分為2組：MVE暴露組（=8）和空白對(duì)照（CTL）組（=8）。采用MVE暴露6個(gè)月的方法建立COPD大鼠模型。造模結(jié)束后，使用Buxco小動(dòng)物有創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)大鼠肺功能；肺組織切片行HE染色并評(píng)估肺組織病理變化；ELISA法檢測(cè)大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和PGE2的水平，評(píng)估大鼠肺部炎癥情況；采用免疫熒光及Western blot法檢測(cè)肺組織COX-2及EP受體蛋白水平；提取肺組織核蛋白，Western blot檢測(cè)MVE對(duì)肺組織NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用MVE細(xì)顆粒物（PM2.5）標(biāo)準(zhǔn)品刺激人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2、IL-6和IL-8的水平；Western blot檢測(cè)細(xì)胞中COX-2及EP受體蛋白水平；收集細(xì)胞核蛋白，檢測(cè)PM2.5對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。（1）MVE長(zhǎng)期暴露致大鼠出現(xiàn)類(lèi)似COPD的癥狀，包括氣道炎癥、肺氣腫及肺功能下降（<0.05）；（2）MVE長(zhǎng)期暴露顯著上調(diào)大鼠肺組織及氣道上皮細(xì)胞COX-2和EP1/EP4受體表達(dá)（<0.05），而對(duì)EP2/EP3受體表達(dá)無(wú)顯著影響（>0.05）；（3）MVE PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞COX-2、PGE2和EP1/EP4表達(dá)水平顯著升高（<0.05），但對(duì)EP2/EP3表達(dá)無(wú)顯著影響（>0.05）；（4）PM2.5暴露誘導(dǎo)大鼠肺組織及BEAS-2B細(xì)胞中NF-κB活化增加（<0.05）。MVE誘導(dǎo)大鼠COPD發(fā)病過(guò)程中，氣道上皮細(xì)胞COX-2-PGE2-EP1/4受體信號(hào)通路成員表達(dá)增加并伴隨NF-κB信號(hào)通路的活化。

機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣；慢性阻塞性肺疾病；COX-2/PGE2/EP受體信號(hào)通路；NF-κB信號(hào)通路

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)性氣流受限為特征，氣流受限呈現(xiàn)進(jìn)行性發(fā)展，其發(fā)病與氣道和肺臟對(duì)有毒有害顆粒或氣體的慢性炎性反應(yīng)相關(guān)［1］。作為普遍存在的空氣污染物，細(xì)顆粒物（fine particulate matter/particulate matter 2.5，PM2.5）是影響人類(lèi)健康的重要危險(xiǎn)因素［2-3］。研究顯示，PM2.5濃度上升與COPD發(fā)病率、死亡率的上升呈正相關(guān)［4］。大氣中PM2.5有多種來(lái)源，其中包括機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣（motor vehicle exhaust，MVE）、工業(yè)污染和揚(yáng)塵等，而MVE的釋放在其中占重要比例［5］。氣道炎癥是COPD重要病理特征之一，炎癥嚴(yán)重程度與COPD的發(fā)病率和死亡率正相關(guān)［6］。因此，研究MVE引發(fā)COPD過(guò)程中慢性氣道炎癥相關(guān)的信號(hào)通路的變化，對(duì)闡明MVE參與COPD發(fā)病的機(jī)制至關(guān)重要。

環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是一種誘導(dǎo)型酶，又稱(chēng)炎癥相關(guān)基因，受到炎癥信號(hào)刺激時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)［7］。COX-2的過(guò)表達(dá)是肺部炎癥的一個(gè)基本特征，COX-2的內(nèi)源性產(chǎn)物前列腺素類(lèi)激素可趨化中性粒細(xì)胞從氣道上皮遷移至氣道內(nèi)［8］。COX-2/前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）信號(hào)通路在煙草煙霧暴露導(dǎo)致的氣道炎癥中起促進(jìn)作用［9］。PGE2作為一種重要的炎癥介質(zhì)，通過(guò)與E-前列腺素類(lèi)激素（E-prostanoid，EP）受體結(jié)合發(fā)揮作用，以啟動(dòng)不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑［10］。EP受體為細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，屬于G蛋白受體超家族，分為4個(gè)亞型，分別為EP1、EP2、EP3和EP4［11］，每個(gè)EP亞型具有不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。PGE2通過(guò)與不同亞型的EP受體結(jié)合發(fā)揮出不同的作用［12］。目前，尚未有報(bào)道顯示COX-2/PGE2/EP信號(hào)通路在MVE暴露引起的COPD大鼠模型氣道炎癥中發(fā)生變化。因此，本研究的目的是探究MVE長(zhǎng)期暴露引起大鼠COPD發(fā)生時(shí)，氣道上皮細(xì)胞中COX-2/PGE2/EP信號(hào)通路成員的表達(dá)變化情況，以期為控制氣道炎癥、治療COPD提供參考資料。

材料和方法

1　動(dòng)物

健康雄性SD純系大鼠（SPF級(jí)），6～8周齡，體重180～230 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002。

2　主要設(shè)備和試劑

檢測(cè)設(shè)備主要有小動(dòng)物有創(chuàng)肺功能儀（Buxco）和全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo）。五羊摩托車(chē)（型號(hào)：WY48QT-2，廣州市汽車(chē)工業(yè)集團(tuán)有限公司）用于產(chǎn)生MVE。白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience；PGE2ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)聯(lián)科生物公司；COX-2、EP1受體、EP2受體、EP3受體、EP4受體和GAPDH抗體購(gòu)自Abcam。人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞購(gòu)自JENNIO；MVE顆粒物PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品（1650b）購(gòu)自NIST；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本東仁化學(xué)科技有限公司；核蛋白提取試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific。

3　主要方法

3.1COPD大鼠模型的建造將16只雄性SD大鼠（SPF級(jí)）按照隨機(jī)原則均分為2組，分別為空白對(duì)照（control，CTL）組（=8）和MVE暴露組（=8）。大鼠的實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)格消毒大鼠接觸物品。將MVE暴露組大鼠放置于MVE暴露系統(tǒng)中，進(jìn)行MVE暴露，造模時(shí)間為6個(gè)月，具體方法參照我們之前發(fā)表方法［13］。具體如下：將MVE暴露組大鼠放置于MVE暴露系統(tǒng)中，啟動(dòng)摩托車(chē)釋放MVE 6 min，并啟動(dòng)暴露系統(tǒng)中的混勻風(fēng)扇進(jìn)行空氣混勻，持續(xù)進(jìn)行MVE暴露2 h，而后打開(kāi)抽風(fēng)機(jī)和空調(diào)進(jìn)行暴露系統(tǒng)內(nèi)換氣，間隔1 h后再次重復(fù)以上步驟一次。每天暴露3次，每次2 h，中間間隔1 h，暴露時(shí)程共計(jì)6個(gè)月。MVE暴露過(guò)程中監(jiān)測(cè)煙氣的顆粒物濃度，持續(xù)監(jiān)測(cè)煙氣中O2、CO2、CO和NO等氣體的濃度。CTL組按照上述模型組造模的步驟在同等條件下放置于MVE暴露系統(tǒng)中，對(duì)CTL組大鼠進(jìn)行正常的空氣暴露。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠的反應(yīng)情況。上述所有動(dòng)物使用及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均在廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督下完成。

3.2大鼠肺功能測(cè)定建模結(jié)束后全部大鼠使用肺功能儀（Buxco公司PFT系統(tǒng)）測(cè)定肺功能。即：大鼠經(jīng)腹腔注射3％戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉后，于頸部甲狀腺處切開(kāi)氣管（切口盡可能小），插入氣管插管，深度適當(dāng)，放入體描箱，連接大動(dòng)物肺功能儀并進(jìn)行機(jī)械通氣。儀器參數(shù)為：呼吸機(jī)的壓力為±20 cmH2O，吸氣氣流流速為4 mL/s，慢速呼氣氣流流速為2 mL/s，吸氣與呼氣最大壓力為±50 cmH2O，呼吸頻率為60 min-1。大鼠與呼吸機(jī)完全協(xié)調(diào)、各參數(shù)變化趨于穩(wěn)定后，開(kāi)始測(cè)定肺功能，記錄吸氣阻力（inspiratory resistance，I）、肺總量（total lung capacity，TLC）、肺靜態(tài)順應(yīng)性（chord compliance，chord）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、50 ms用力呼氣量（forced expiratory volume in 50 ms，F(xiàn)EV50）和肺活量（vital capacity，VC）等指標(biāo)。

3.3BALF炎癥指標(biāo)測(cè)定全部大鼠肺功能檢查后，暴露氣道，行留置針氣管內(nèi)插管，用生理鹽水沖洗雙肺1次，每次8 mL，回收得到BALF，每只大鼠盡量回收得到相同體積的BALF。ELISA法檢測(cè)BALF中PGE2、IL-6及TNF-α濃度。同時(shí)收集BALF底部的細(xì)胞行Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，高倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比。

3.4肺泡平均線性截距（mean linear intercept，MLI）的測(cè)定將肺臟經(jīng)氣管于20 cm高度灌注4%多聚甲醛，4 ℃固定過(guò)夜。然后經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、切片（4 μm）進(jìn)行肺氣腫評(píng)估，具體如下：肺組織切片經(jīng)HE染色后，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析肺泡的MLI，用每個(gè)視野下的總長(zhǎng)度除以肺泡的個(gè)數(shù)得到MLI，每只大鼠至少取3個(gè)視野，取平均值，每組觀察5只大鼠。

3.5石蠟切片免疫熒光（1）石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15 min-二甲苯Ⅱ 15 min-無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min-無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-蒸餾水洗；（2）抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 9.0）的修復(fù)盒放于有一定量水的高壓鍋內(nèi)，電磁爐加熱至氣孔開(kāi)始噴氣，停止加熱，釋放壓力，將切片置于修復(fù)盒內(nèi)，電磁爐加熱至氣孔開(kāi)始噴氣，5 min后關(guān)閉電磁爐，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min；（3）畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min；（4）血清封閉：在圈內(nèi)滴加BSA孵育30 min；（5）加Ⅰ抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加稀釋于PBS的Ⅰ抗（COX-2、EP1、EP2、EP3和EP4），切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）；（6）加Ⅱ抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與Ⅰ抗相對(duì)應(yīng)種屬的II抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min；（7）DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵10 min；（8）封片：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

3.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力在96孔板中接種BEAS-2B細(xì)胞懸液（每孔約5 000個(gè)細(xì)胞）。在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，給予含不同濃度PM2.5的培養(yǎng)液培養(yǎng)（終濃度為0、20、50、100和200 μg/mL），將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育48 h，棄除原培養(yǎng)液，加入一定比例含有CCK-8的培養(yǎng)液（培養(yǎng)液∶CCK-8=9∶1），每孔100 μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

3.7細(xì)胞培養(yǎng)和處理BEAS-2B細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收獲細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種于6孔板中，24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)良好，達(dá)到約70%接觸，棄去舊培養(yǎng)液，更換為含1% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)24 h后以PM2.5（100 mg/L）處理48 h。

3.8肺組織核蛋白的提取（1）將40 g肺組織切成碎片，置于1.5 mL離心管內(nèi)；（2）加入1 mL PBS重懸肺組織，800×離心5 min，去上清；（3）加入預(yù)冷的CER solution I 400 μL，蝸旋振蕩15 s，置于冰上15 min，然后加入預(yù)冷的CER solution Ⅱ 22 μL，蝸旋振蕩5 s，置于冰上1 min，再次蝸旋振蕩5 s后，14 000×離心10 min；（4）收集上清即為胞漿蛋白，往沉淀加入預(yù)冷的NER 100 μL，劇烈振蕩15 s，冰上10 min，重復(fù)4次，14 000×離心20 min，收集上清，即為核蛋白。

3.9細(xì)胞核蛋白的提取（1）在100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)加入1 mL trypsin-EDTA消化收集16HBE細(xì)胞，800×離心10 min，去上清；（2）加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，800×離心10 min，去上清；（3）加入預(yù)冷的CER solution I 400 μL，蝸旋振蕩30 s，置于冰上10 min，加入預(yù)冷的CER solution II 22 μL，蝸旋振蕩10 s，置于冰上5 min，再次蝸旋振蕩5 s后14 000×離心10 min；（4）收集上清即為胞漿蛋白，往沉淀中加入預(yù)冷的NER 2 100 μL，劇烈振蕩15 s，冰上15 min，重復(fù)4次，最后14 000×離心10 min，收集上清，即為核蛋白。

3.10Western blot檢測(cè)組織和細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平將從肺組織或細(xì)胞中提取的總蛋白，用SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后電轉(zhuǎn)到PDVF膜上。脫脂奶封閉膜上非特異位結(jié)合點(diǎn)后，依次加入親和純化的目標(biāo)蛋白特異性抗體進(jìn)行孵育，加入偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的抗兔或抗大鼠IgG孵育，加入過(guò)氧化物酶底物ECL檢測(cè)II抗信號(hào)。Western blot圖像由Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲得，并采用ImageJ軟件半定量分析。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩樣本之間的差異性比較采用檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

校園的秋天是明麗的，也是熱鬧的，更是多彩的，還是安靜的。在達(dá)州嘉祥學(xué)習(xí)、生活的我，享受著秋日校園的美麗和寧?kù)o。

結(jié)果

1　兩組大鼠肺功能參數(shù)的比較

建模結(jié)束后，測(cè)量的肺功能參數(shù)中，MVE處理組大鼠TLC、chord和I均較CTL組顯著增加（<0.05），而呼氣流速參數(shù)FEV50/FVC則顯著下降（<0.05），見(jiàn)表1。

表1　兩組大鼠肺功能參數(shù)比較

CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust； TLC： total lung capacity；chord： chord compliance；I： inspiratory resistance； FEV50： forced expiratory volume in 50 ms； FVC： forced vital capacity. 1 cmH2O≈0.098 kPa.P<0.05CTL group.

2　慢性非特異性炎癥的比較

與CTL組相比較，MVE處理組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類(lèi)數(shù)（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）及炎癥因子IL-6和TNF-α的水平均顯著升高（<0.05），見(jiàn)表2、3。

表2　兩組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)比較

CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust.*<0.05CTL group.

表3　兩組大鼠BALF中IL-6和TNF-α含量的比較

CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust.*<0.05CTL group.

3　肺組織病理學(xué)改變

HE染色顯示，CTL組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；MVE大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄甚至斷裂，呈現(xiàn)囊狀擴(kuò)張，肺泡腔擴(kuò)大，部分肺泡融合成肺大皰，見(jiàn)圖1。與CTL組相比，MVE組大鼠肺泡MLI顯著增大（<0.05），見(jiàn)表4。

Figure 1.Histopathological changes of lung tissues in rats （HE staining）. The lung tissues of the rats exposed to motor vehicle exhaust （MVE） exhibited COPD-like changes including airspace enlargement （red arrows） induced by alveolar destruction.

表4　兩組大鼠肺組織肺泡平均線性截距的比較

CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust.*<0.05CTL group.

4　大鼠BALF中PGE2含量測(cè)定

與CTL組相比，MVE組大鼠BALF中PGE2含量顯著升高（<0.05），見(jiàn)表5。

表5　兩組大鼠BALF中PGE2含量比較

CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust.*<0.05CTL group.

5　COX-2和EP受體在大鼠肺組織及氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)變化

與CTL組相比，MVE大鼠肺組織中的COX-2、EP1受體及EP4受體蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05），而EP2受體和EP3受體蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化（>0.05），見(jiàn)圖2。進(jìn)一步對(duì)肺組織切片進(jìn)行針對(duì)COX-2和EP受體的免疫熒光染色，結(jié)果顯示COX-2、EP1受體及EP4受體在大鼠氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Comparison of protein levels of COX-2 and EP receptors in rat lung tissues between the two groups. CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs CTL group.

Figure 3.The expression and location of COX-2 （A），EP1 receptor （B），EP2 receptor （C），EP3 receptor （D） and EP4 receptor （E） in the bronchial epithelium of rats detected by immunofluorescence staining （scale bar=50 μm）. The results showed that the expression levels of COX-2，EP1 receptor and EP2 receptor were significantly increased in the airway epithelial cells of the rats exposed to motor vehicle exhaust （MVE）.

6　PM2.5對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活力及PGE2、IL-6和IL-8分泌的影響

低濃度（0～100 mg/L）的MVE PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)期暴露未對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活力造成顯著影響，而高濃度（200 mg/L）的MVE PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降（<0.05），見(jiàn)表6。

表6　PM2.5對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

*<0.050 mg/L group.

與CTL組相比，100 mg/L的MVE PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品刺激48 h可顯著提高BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-8及PGE2的水平（<0.05），見(jiàn)表7。

表7　PM2.5（100 mg/L）對(duì)BEAS-2B細(xì)胞IL-6、IL-8及PGE2分泌的影響

*<0.05control （CTL） group.

7　PM2.5對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2和EP受體表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of PM2.5 on the expression of COX-2 and EP receptors in BEAS-2B cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control （CTL） group.

8　NF-κB p65在大鼠肺組織活化情況

與CTL組相比，MVE組大鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高（<0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 5.Comparison of activation of NF-κB in rat lung tissues between the two groups. CTL： control； MVE： motor vehicle exhaust. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs CTL group.

9　PM2.5對(duì)BEAS-2B細(xì)胞NF-κB p65活化水平的影響

PM2.5（100 mg/L）長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高（<0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 6.The effect of PM2.5 on the activation of NF-κB in BEAS-2B cells. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control （CTL） group.

討論

COPD是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)性氣流受限為特征，氣流受限呈現(xiàn)進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺臟對(duì)有毒有害顆粒或氣體的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)［1］。慢性氣道炎癥是COPD的重要病理特征之一，氣道炎癥的加重可增加COPD的發(fā)病率和死亡率［6］。PM2.5與COPD患者氣道慢炎癥的發(fā)生密切相關(guān)［14-15］。但目前對(duì)PM2.5導(dǎo)致的氣道炎癥相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很不充分。

對(duì)于人類(lèi)而言，臨床上通過(guò)肺功能檢查診斷COPD，具體方法是患者吸入支氣管擴(kuò)張劑后，F(xiàn)EV1/FVC<0.7提示持續(xù)氣流受限的存在即可確診COPD［1］。在本研究中，我們采用MVE暴露6個(gè)月建立COPD大鼠模型。較CTL組，MVE組大鼠的肺功能參數(shù)TLC、chord和I等顯著上升以及呼氣流速指標(biāo)FEV50/FVC比值顯著下降，一定程度上說(shuō)明大鼠氣流受限，符合COPD的生理變化。同時(shí)，肺組織切片顯示模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄，部分融合成肺大泡，這些特征與人類(lèi)COPD患者肺組織的病理一致。而大鼠BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞因子IL-6和TNF-α蛋白含量均顯著升高，則提示存在氣道炎癥。

慢性氣道炎癥是COPD病理生理學(xué)的核心，氣道炎癥加重引起的氣道粘液高分泌、氣道狹窄，導(dǎo)致肺功能進(jìn)一步惡化，最終導(dǎo)致患者死亡［16］。PGE2作為一種重要的炎癥因子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。有研究表明，COPD患者呼出氣冷凝物中的PGE2含量明顯高于正常對(duì)照組，且其含量與COPD病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［17］，而與FEV1/FVC值呈負(fù)相關(guān)［18］。有研究表明COX-2、EP4受體和PKA抑制劑有助于減少炎癥中PGE2的含量，這提示COX-2-EP4受體-PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能通過(guò)PGE2參與組織損傷［19］。在本研究中，較CTL組，MVE組大鼠BALF中PGE2含量顯著升高，肺組織及氣道上皮細(xì)胞中COX-2、EP1受體和EP4受體的含量也顯著升高，而EP2和EP3受體無(wú)顯著變化。這說(shuō)明在MVE暴露誘導(dǎo)的COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，COX-2-PGE2可能是傾向于激活EP1/4受體進(jìn)而促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生。

肺上皮細(xì)胞是PM2.5接觸和沉積的重要靶細(xì)胞，在肺識(shí)別和處理吸入顆粒物質(zhì)中起到重要作用［20］。所以，我們觀察COX-2-PGE2信號(hào)通路在COPD氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)改變，希望能更好地了解COPD發(fā)病機(jī)制。因此選擇使用MVE PM2.5標(biāo)準(zhǔn)品刺激人氣道上皮細(xì)胞（BEAS-2B）用來(lái)模擬體內(nèi)MVE誘導(dǎo)COPD發(fā)生時(shí)上皮細(xì)胞的反應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，PM2.5刺激BEAS-2B細(xì)胞在引起細(xì)胞因子IL-6和IL-8釋放增加的同時(shí)，上調(diào)細(xì)胞COX-2、PGE2、EP1受體和EP4受體的表達(dá)，而對(duì)EP2和EP3受體無(wú)明顯影響，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)調(diào)控中扮演中心樞紐的角色［21］。在本研究中，PM2.5暴露誘導(dǎo)大鼠肺組織及BEAS-2B細(xì)胞中NF-κB活化增加，與之前關(guān)于PM通過(guò)NF-κB途徑上調(diào)人肺上皮細(xì)胞（A549）中COX-2和PGE2表達(dá)的報(bào)道一致［22］，提示NF-κB途徑可能參與了MVE誘發(fā)COPD過(guò)程中COX-2/PGE2/EP受體信號(hào)通路的激活及其調(diào)控的肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

目前，尚未有研究報(bào)道COX-2/PGE2/EP受體信號(hào)通路在MVE暴露引起的COPD大鼠模型氣道炎癥中發(fā)生變化。我們的結(jié)果表明，COX-2-PGE2信號(hào)通路成員在這一過(guò)程中表達(dá)水平增高，但其具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究，NF-κB活化可能參與其中。由于MVE組大鼠肺組織及氣道上皮細(xì)胞中僅有EP1和EP4受體的含量顯著升高，EP2和EP3受體無(wú)顯著變化，而不同的EP受體發(fā)揮不同作用，這提示阻斷或者興奮某一種EP受體可能成為靶向治療COPD的潛在手段。

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Activation of COX-2/PGE2/EP receptor pathway in airway epithelial cells from COPD rats induced by exhaust emissions of vehicles

LI De-fu1，CHEN Jian-an1，YUAN Liang2，ZHANG Jia-xin1，YE Yuan-yuan1，YI Gao1△

（1，，510700，；2，，510120，）

To study the effects of motor vehicle exhaust （MVE） exposure on the changes of cyclooxygenase-2 （COX-2）/prostaglandin E2（PGE2）/E-prostanoid （EP） receptor signaling pathway in airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease （COPD） model rats.Sixteen male SD rats were randomly divided into MVE inhalation group （=8） and control （CTL） group （=8）. A COPD rat model was established after a 6-month MVE exposure. Lung functions were assessed using Buxco lung function measurement system. The lung tissue slices were subjected to HE staining for pathological evaluation. The inflammatory cells from bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were counted，and the levels of PGE2，interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in BALF were assayed by ELISA. Furthermore，cultured normal human bronchial epithelial BEAS-2B cells were used to evaluate the effects of PM2.5 on COX-2/PGE2/EP receptor signaling pathway. The PGE2，IL-6 and TNF-α levels in cell culture medium were assayed by ELISA. The expression levels of COX-2，PGE2，EP1，EP2，EP3 and EP4 in lung tissues and BEAS-2B cells were determined by Western blot. The NF-κB nuclear translocation in lung tissues and BEAS-2B cells was evaluated by Western blot.Long-term MVE exposure resulted in COPD-like symptoms，including lung inflammation，emphysema and lung function decline，accompanied with increased protein levels of COX-2 and EP1/EP4 receptors in lung tissues and airway epithelial cells of the rats （<0.05）. The protein levels of EP2 and EP3 receptors were not changed by MVE exposure （>0.05）. In BEAS-2B cells，PM2.5 stimulated the secretion of PGE2，IL-6 and IL-8，and increased the expression of COX-2，PGE2and EP1/EP4 receptors （<0.05）. The protein levels of EP2 and EP3 receptors remained unchanged （>0.05）. Furthermore，nuclear translocation of NF-κB was observed in both MVE-exposed rat lung tissues and PM2.5-treated BEAS-2B cells （<0.05）.Exposure to MVE promotes COPD through COX-2-PGE2-EP1/4 receptor signaling pathway and NF-κB nuclear translocation in airway epithelial cells.

Motor vehicle exhaust； Chronic obstructive pulmonary disease； COX-2/PGE2/EP receptor signaling pathway； NF-κB signaling pathway

R563； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.001

1000-4718（2022）02-0193-09

2021-07-28

2022-02-08

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81900033）；廣州市科學(xué)技術(shù)局基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No. 202102020129）

Tel： 15360802191； E-mail： 15360802191@163.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）