加味二至丸通過抑制鐵死亡減輕高脂血癥小鼠肝臟脂質沉積*

馬貴萍， 于忠楊， 卿立金， 李俊龍， 洪創雄，2△

加味二至丸通過抑制鐵死亡減輕高脂血癥小鼠肝臟脂質沉積*

馬貴萍1，2，3， 于忠楊4， 卿立金1， 李俊龍1， 洪創雄1，2△

（1廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405；2廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；3廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510405；4青島市第六人民醫院，山東 青島 266033）

觀察加味二至丸對高脂血癥模型小鼠肝臟脂質沉積及鐵死亡相關蛋白表達的影響。30只-/-小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組和加味二至丸組，每組10只，另取10只相同背景的C57BL/6J小鼠作為正常對照組。模型組及各治療組均給予高脂飼料喂養，正常對照組給予普通飼料喂養。造模12周后按分組分別給予相應的藥物灌胃，正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。藥物干預10周以后取小鼠血清及肝組織，全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量；HE染色和油紅O染色觀察小鼠肝組織形態及脂質沉積；試劑盒檢測肝組織及血清中還原型谷胱甘肽（GSH）水平及肝組織中的鐵含量；RT-qPCR及Western blot檢測肝組織中鐵死亡相關因子GPx4、SLC7A11、p53、NOX1、COX2和FTH1的mRNA及蛋白表達。與模型組相比，加味二至丸組小鼠血清TC、TG和LDL-C明顯降低，HDL-C含量明顯升高（<0.05）；血清及肝組織GSH水平明顯升高（<0.05），肝臟鐵沉積明顯緩解（<0.05）；肝組織脂滴變小且脂肪變性程度明顯減輕；加味二至丸組小鼠肝組織p53、COX2和NOX1的mRNA及蛋白表達水平明顯下降（<0.05），SCL7A11、GPx4和FTH1的mRNA及蛋白表達水平明顯升高（<0.05）。加味二至丸可以減輕高脂血癥模型小鼠肝臟脂質沉積，可能與抑制肝臟鐵死亡途徑相關。

加味二至丸；高脂血癥；鐵死亡；肝臟脂質沉積；小鼠

高脂血癥是臨床上常見的一種體內脂質代謝紊亂性疾病，主要表現為血清脂蛋白和脂質水平升高，是多種心腦血管疾病的高危因素之一，嚴重危害人類健康［1］。肝臟是機體調控、平衡血脂的重要樞紐器官，是脂類合成和分解的重要場所，肝臟功能受損會導致脂代謝失衡，導致脂質沉積［2］。鐵死亡是近年來才被證實的區別于壞死、凋亡和自噬等的一種全新細胞死亡方式，其特征在于由鐵離子依賴的氧化損傷引起，以脂質活性氧增多和線粒體皺縮為標志［3］。據報道，鐵死亡參與了許多病理過程，包括腫瘤的發展、創傷性腦損傷、神經退行性疾病、葉酸誘導的腎臟損傷以及冠狀動脈疾病［4-7］。近幾年的研究發現，脂質代謝性疾病與鐵死亡密切相關，脂質代謝紊亂導致脂質過氧化增多可能是引起鐵死亡發生所必要的條件之一［8］。例如，有研究證實，鐵死亡抑制劑羅格列酮和去鐵螯合劑去鐵酮聯合可以改善脂肪肝的脂質沉積，減少肝細胞死亡等［9］。因此，圍繞鐵死亡這一新型細胞死亡方式開展深入的研究工作，探明肝臟內鐵死亡的調控機制對揭示高脂血癥的發病機制具有重要的理論研究意義和潛在的臨床應用價值。

加味二至丸（Jiawei-Erzhi pills）是本課題組以經典名方二至丸為基礎加上淫羊藿組方而成，全方共奏補益肝腎，陰陽雙補之功效。我們課題組以往的研究表明，加味二至丸中藥物具有調節血脂代謝、抑制內皮素1、促進一氧化氮釋放、抗炎及類雌激素作用［10-11］。但既往的研究局限于調節血脂、改善內皮功能、抗血管收縮等方面，對高脂血癥形成后肝臟脂質沉積后的過氧化反應及其可能引起的鐵死亡尚未深入研究，因此本研究擬從加味二至丸抗氧化、抗鐵死亡的角度，進一步探討其減輕肝臟脂質沉積的機制，以期為高脂血癥的防治提供新思路。

材料和方法

1　材料

1.1實驗動物載脂蛋白E基因敲除（-/-）小鼠，雄性，6～8周齡，體重（20±2） g，30只；同背景的C57BL/6J品系小鼠雄性，體重（20±2） g，10只，購自廣東藥康生物科技有限公司，許可證號為SYXK（粵）2018-0092。飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，SPF級，自由飲食飲水，環境溫度為（22±1） ℃，濕度50%±5%。本研究動物實驗得到廣州中醫藥大學第一附屬醫院動物管理委員會批準實施（批準號：TCMF1-2021013）。

1.2藥物酒女貞子（批號：N1820933，廣東粵藥）；淫羊藿（批號：2106189，中山仙逸堂）；墨旱蓮（批號：201101，廣東天誠），購自廣州中醫藥大學第一附屬醫院。中藥復方加味二至丸以水煎煮后，濃縮為所需濃度，4 ℃保存待用。

1.3主要試劑與儀器RNAiso PLUS（貨號：9109）、TB Green試劑盒（貨號：RR820A）和RNA反轉錄試劑盒（貨號：RR037A）均購自TaKaRa；SLC7A11抗體（貨號：26864-1-AP）、GPX4抗體（貨號：67763-1-Ig）、p53抗體（貨號：60283-2-Ig）、NOX1抗體（貨號：17772-1-AP）和COX2抗體（貨號：66351-1-Ig）均購自Proteintech；FTH1抗體（貨號：A1144）購自ABclonal；β-actin抗體（貨號：#4970）購自CST；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒（貨號：A006-2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1-1）購自南京建成生物工程研究所；鐵檢測試劑盒（貨號：TC1015）購自雷根生物；超特敏ECL顯影液（貨號：EC1929-01）購自Bioagrio；脫脂奶粉（貨號：D8340）購自索萊寶；Ⅰ抗稀釋液（貨號：P0256）和Ⅱ抗稀釋液（貨號：P0258）購自碧云天。

超純水處理儀器（Millipore）；顯微鏡成像系統（OLYMPUS）；實時熒光定量基因擴增儀（型號：CFX96 Touch； Bio-Rad）；酶標儀（艾本德）；多功能成像分析系統（Bio-Rad）；4 ℃離心機（艾本德）；組織勻漿機（型號：MagNA Lyser； ROCHE）；低溫高速離心機（型號：Allegra X-30R； Beckman）；熒光顯微鏡（型號：BX50； OLYMPUS）。

2　方法

2.1藥液制備按照體表面積法，將小鼠（20 g）與人（70 kg）的中藥劑量進行換算（換算系數9.1）。加味二至丸中藥飲片10付煎煮，加水1 mL浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并2次煎液，通風櫥中分別加熱濃縮至所需濃度，分裝后-20 ℃冰箱保存備用。

2.2動物分組及模型制備10只C57BL/6J小鼠設為正常對照（control，Con）組，予普通飼料喂養。30只雄性-/-小鼠，予高脂西方飲食飼料（脂肪21％，膽固醇0.15％，蛋白質15.5％）喂養，造模持續12周。隨機取2只-/-小鼠進行驗證，采用隨機數字表隨機將剩余28只-/-小鼠分為辛伐他?。⊿im）組、加味二至丸（Ezw）組，每組10只，模型（model，Mod）組8只。

2.3給藥造模12周后，正常對照組繼續予普通飼料喂養并用生理鹽水灌胃，模型組、辛伐他汀組、加味二至丸組則予高脂西方飲食飼料喂養，并按照分組給予相應藥物灌胃。按照上述2.1藥物制備方法，加味二至丸組小鼠給藥劑量為0.29 g·kg-1·d-1，給藥濃度為1.45 g/mL；辛伐他汀組小鼠給藥劑量為0.05 g·kg-1·d-1，給藥濃度為0.25 g/mL。灌胃1天1次，每次0.2 mL，持續10周。

2.4標本采集末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，腹腔麻醉，眼眶取血，血液室溫靜置半小時后，3 000 r/min離心15 min，將分離后的上清液進行分裝。生理鹽水心臟灌流后迅速剖取肝臟組織，-80 ℃凍存用以指標檢測，并取適宜大小的肝組織于4%多聚甲醛液中固定用以HE、油紅O染色。

2.5測量體重變化在小鼠開始造模后，每2周記錄一次小鼠的體重變化，觀察小鼠的狀態。

2.6檢測血脂含量全自動生化儀檢測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。檢測由廣州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科全自動生化鑒定儀協助完成。

2.7HE染色觀察肝臟組織形態學改變取在4%多聚甲醛中固定的肝組織，采用HE染色法觀察各組小鼠主動脈組織形態學變化。將主動脈組織于4%多聚甲醛固定24 h后，梯度脫水透明后石蠟包埋，行5 μm厚切片，60 ℃溫箱烤片后，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，置入蘇木素染缸中染色，鹽酸乙醇分化后自來水沖洗返藍，將切片置入伊紅染缸中染色2 min，脫水透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

2.8油紅O染色觀察肝臟脂質沉積取各組肝臟依次放入15%和30%蔗糖中脫水，包埋做成冰凍切片，油紅O染色10 min，75%乙醇分化2 s，蘇木素復染2 min，流水沖洗返藍，甘油明膠封片，光鏡下觀察。

2.9小鼠血清及肝組織GSH含量檢測取0.1 g小鼠肝組織研磨成勻漿液，用預冷生理鹽水將其按1∶9的比例稀釋待用。將100 μL待測樣品稀釋液、25 μL顯色劑及100 μL緩沖液混勻后，室溫靜置5 min。用酶標儀在激發波長405 nm下檢測吸光度（）。上述檢測均按試劑盒說明書操作。

2.10小鼠肝組織鐵含量檢測小鼠肝臟取材及組織上清液制備同上，采用分光光度法以亞鐵嗪為底物進行鐵含量檢測，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.11RT-qPCR檢測p53、FTH1、SCL7A11、GPx4、PTGS2及NOX1的mRNA表達所有引物設計與合成委托上海閃錦分子生物科技有限公司完成。按照Trizol試劑盒說明書抽提肝臟總RNA。逆轉錄反應體系20 μL，反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。PCR體系為20 μL，反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，39個循環。實驗重復3次，以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt法計算相對量。引物序列及擴增片段詳見表1。

表1　引物序列

F： forward； R： reverse.

2.12Western blot檢測p53、FTH1、SCL7A11、GPx4、COX2及NOX1的蛋白表達采用RIPA裂解液裂解肝組織，依據BCA蛋白質定量試劑方法進行蛋白定量，采用10% SDS-PAGE分離蛋白，并進行PVDF轉膜與5%脫脂奶粉封閉，加入Ⅰ抗（FTH1、SLC7A11、GPx4和NOX1，1∶1 000稀釋；p53和COX2，1∶2 000稀釋）4 ℃過夜，用0.1％ TBST洗滌8 min×4次，再加入相應HRP標記的Ⅱ抗（1∶3 000稀釋）孵育，0.1％ TBST洗滌，ECL化學發光顯影，最后用ImageJ多色熒光/化學發光系統掃描成像與半定量分析。

3　統計學處理

應用SPSS 21.0統計軟件分析處理實驗數據。計量資料服從正態分布或近似正態分布以均數±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD-檢驗；計量資料不服從正態分布，不符合正態分布的用中位數表示，采用非參數檢驗。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　各組小鼠體重變化

小鼠在進行藥物干預后體質量變化趨勢如圖1A所示，模型組小鼠體質量較高，辛伐他汀組與加味二至丸組小鼠體質量則低于模型組，但高于正常對照組。圖1B中對小鼠給藥干預0周及10周體質量進行對比，發現在干預0周及10周時，模型組小鼠體質量均顯著高于正常對照組（<0.01）；在藥物干預0周時，兩個給藥組小鼠體質量明顯高于正常對照組（<0.05），但與模型組無明顯差異（>0.05）；在藥物干預10周后，辛伐他汀組及加味二至丸組小鼠體質量顯著低于模型組（<0.01），加味二至丸組小鼠體質量更接近正常對照組小鼠（>0.05）。

Figure 1.The body weight change trend diagram of mice after drug intervention. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs Con group； #P<0.05，##P<0.01 vs Mod group.

2　各組小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量

如表2所示，與正常對照組相比，模型組TC、TG和LDL-C明顯升高（<0.05），HDL-C顯著下降（<0.01），提示高脂血癥模型成功；與模型組相比，辛伐他汀組小鼠血清TC和TG降低（<0.05），LDL-C顯著降低（<0.01），而HDL-C升高不明顯；加味二至丸組小鼠血清TC、TG和LDL-C含量降低，HDL-C升高，差異具有統計學意義（<0.05）。

表2　各組小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量

Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills.*<0.05，**<0.01Con group；#<0.05，##<0.01Mod group.

3　各組小鼠肝臟組織形態學變化

各組小鼠肝臟HE染色結果如圖2所示，正常對照組肝小葉結構正常，肝細胞為圓形，細胞核居中，胞漿內未見脂滴，排列方式為條索狀且肝竇不狹窄；模型組肝細胞體積變大，胞漿內可見大量的脂肪空泡，且大小不等，肝竇狹窄或消失；辛伐他汀組脂滴明顯減少，其病理改變較模型組明顯減輕，可見到正常的肝細胞，肝竇狹窄程度顯著減輕；加味二至丸組肝細胞脂肪變性程度減輕，脂肪空泡明顯減少，肝竇狹窄有所減輕，其效果與模型組相比顯著減輕。

Figure 2.Pathological changes of liver tissue （HE staining，scale bar=100 μm）. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills.

4　各組小鼠肝臟油紅O染色結果

如圖3所示，正常對照組小鼠肝臟細胞排列規整，肝細胞內未見紅色脂滴，細胞核為藍色，肝竇結構正常；模型組小鼠肝臟細胞腫脹明顯，肝細胞間隙變寬，視野出現彌漫性紅色脂滴，細胞核大小不等，脂質蓄積程度明顯加重；辛伐他汀組和加味二至丸組肝臟細胞內紅色脂滴顯著減少，細胞核明顯變小，肝竇結構有所恢復或恢復正常，脂質蓄積程度顯著減輕。

Figure 3.Lipid deposition in the liver （oil red O staining，scale bar=100 μm）. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Con group； ##P<0.01 vs Mod group.

5　各組小鼠肝組織和血清中GSH含量

如圖4所示，與正常對照組相比，模型組、辛伐他汀組和加味二至丸組小鼠肝組織和血清GSH含量顯著減少（<0.01）；與模型組相比，辛伐他汀組和加味二至丸組小鼠肝組織GSH含量均明顯增加（<0.05），辛伐他汀組小鼠血清GSH含量顯著增加（<0.01），加味二至丸組小鼠血清GSH含量雖有增加趨勢，但差異不具有統計學意義（>0.05）。

Figure 4.The GSH content in liver tissue （A） and serum （B） of the mice. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs Con group； #P<0.05，##P<0.01 vs Mod group.

6　各組小鼠肝組織鐵含量表達

如圖5所示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟組織鐵含量明顯增加（<0.05）；與模型組相比，辛伐他汀組與加味二至丸組小鼠肝臟組織鐵含量明顯下降（<0.05）。

Figure 5.The iron content in liver tissues of the mice. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Con group； #P<0.05 vs Mod group.

7　各組小鼠肝臟p53、FTH1、SCL7A11、GPx4、PTGS2及NOX1的mRNA表達變化

如表3所示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟p53、NOX1和PTGS2 mRNA表達明顯升高（<0.05），SLC7A11、GPx4和FTH1 mRNA表達明顯下降（<0.05）；與模型組相比，辛伐他汀組NOX1明顯下降（<0.05），p53和COX2則呈上升趨勢，但差異無統計學意義（>0.05），SCL7A11、GPx4、FTH1 mRNA表達明顯升高（<0.05）；加味二至丸組p53、PTGS2和NOX1 mRNA水平明顯下降（<0.05），SCL7A11、GPx4和FTH1 mRNA水平明顯升高（<0.05），GPx4呈上升趨勢，但差異無統計學意義（>0.05）。

Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills.*<0.05，**<0.01Con group；#<0.05，##<0.01Mod group.

8　各組小鼠p53、FTH1、SCL7A11、GPx4、COX2及NOX1的蛋白表達變化

如圖6所示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟組織p53、NOX1和COX2蛋白水平明顯升高（<0.05），SCL7A11、GPx4和FTH1表達水平明顯降低（<0.05）；與模型組相比，辛伐他汀組小鼠肝臟p53蛋白表達明顯下降（<0.05），NOX1和COX2蛋白表達呈下降趨勢，但差異無統計學意義（>0.05），SCL7A11、GPx4和FTH1表達水平明顯升高（<0.05）；加味二至丸組小鼠p53、NOX1和COX2蛋白表達水平明顯降低（<0.05），SCL7A11、GPx4和FTH1表達水平明顯升高（<0.05）。

Figure 6.The expression of liver-related proteins in the mice of each group. Con： control； Mod： model； Sim： simvastatin； Ezw： Jiawei-Erzhi pills. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs Con group； #P<0.05，##P<0.01 vs Mod group.

討論

近30年來，中國人群的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加，中國成人血脂異常總體患病率高達40.40%，較2002年呈大幅度上升，預示未來中國成人血脂異常患病及相關疾病負擔將繼續加重［12］。鐵死亡是一種主要由鐵依賴的脂質過氧化介導的調節型細胞死亡，特征是線粒體結構異常，鐵和脂質過氧化氫水平升高［13-14］。過量的鐵促進Fenton反應產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），加速脂質過氧化［15］。肝臟脂質代謝異常是高脂血癥的重要誘因，研究發現，當外源因素介入時，細胞內脂代謝失衡，還原相關脂質基因下調或氧化相關脂質基因上調都將誘導細胞發生鐵死亡［16］。因此，通過鐵死亡途徑調控肝臟脂質代謝平衡為防治高脂血癥提供了一個新視角。

中醫學雖然沒有特指“高脂血癥”的病名，但根據高脂血癥的臨床癥候及繼發性疾病的特點，可以將其與中醫的多種疾病如“痰飲”“肥胖”“心悸”“胸痹”“眩暈”等相關聯。其致病臟腑主要涉及脾、腎、肝，而病理機制主要為“本虛標實”，以氣、血、陰、陽虧虛為本，痰濁、瘀血為標。在高脂血癥的致病因素中，以“痰”“瘀”“虛”三者為基礎，導致肝、脾、腎功能失調，從而引起津液代謝失調，產生高脂血癥。加味二至丸是由女貞子、墨旱蓮和淫羊藿按1∶1∶1的比例組成，是在中醫經典名方二至丸的基礎上加味而成。二至丸由女貞子和墨旱蓮組成，二至丸藥少而精，配伍精妙，具有滋補肝腎之功效。并且有研究表明，淫羊藿苷可介導Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠腎缺血再灌注損傷和氧化損傷［17］，并且淫羊藿苷可抑制骨髓間充質干細胞鐵死亡［18］，特女貞苷可顯著減輕血管內皮細胞氧化損傷［19］，旱蓮草有效成分旱蓮草總黃酮也具有顯著的抗氧化損傷［20］，由此我們可以發現淫羊藿、旱蓮草和女貞子這3味中藥在抗氧化損傷及鐵死亡方面具有潛在意義。

正常機體內的鐵除了來自腸道吸收的飲食源性鐵元素之外，大部分來自于巨噬細胞對循環中衰老紅細胞的吞噬處理作用。當細胞內游離鐵過多時，大量游離鐵通過Fenton反應產生活性氧自由基ROS，加速LDL的氧化，大量的氧化型LDL被巨噬細胞吞噬后形成泡沫細胞，沉積于血管內皮，從而導致肝臟鐵死亡。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4）作為谷胱甘肽過氧化物酶蛋白家族中的唯一成員，以鐵死亡過程中產生的脂質ROS作為特異性底物，利用GSH作為還原劑將其還原，是最先確認的鐵死亡重要負性調控蛋白［21］。GPx4是主要的修復酶，其以GSH作為輔助因子抑制鐵死亡的發生。研究發現，小鼠中敲除會導致腎細胞發生鐵死亡進而造成腎衰竭［22］；此外應用小分子化合物抑制GPx4能促進腫瘤細胞發生鐵死亡，而外源性補入GSH能抑制鐵死亡［21］。已有研究表明在腫瘤細胞中，p53激活是鐵死亡發生的必要條件，p53能夠抑制下游基因表達，SLC7A11表達被抑制后會減低甚至消耗GSH水平而使GPx4失活［23］。本次實驗結果表明，加味二至丸可以降低小鼠肝臟組織p53的表達，使p53對SLC7A11的抑制作用減弱，進一步提高小鼠血清及肝臟組織的GSH表達，從而使GPx4的表達上升而抑制鐵死亡的發生。同時p53還能夠激活PTGS2的表達而升高NOX1介導的脂質過氧化水平，增加ROS反應活性進而導致細胞鐵死亡的發生［24］，本次實驗結果也證實，加味二至丸組小鼠肝臟組織的PTGS2、NOX1表達明顯下降，肝臟脂質過氧化水平明顯減輕。FTH1具有鐵氧化酶活性，可調控儲存鐵離子，對維持鐵的穩態并將鐵傳遞到細胞中發揮重要作用。FTH1的表達減少與鐵死亡發生密切相關，最近研究發現，自噬增加可降解鐵蛋白FTH1的表達從而增加鐵水平，導致Fenton反應而發生氧化損傷［25-26］。本次實驗也對小鼠肝臟FTH1的mRNA及蛋白的表達做了檢測，結果發現加味二至丸可明顯升高小鼠肝臟FTH1的mRNA及蛋白表達水平，從而更好地調控鐵離子，減輕肝臟鐵沉積，維持鐵穩態。

綜上所述，加味二至丸可通過拮抗肝細胞鐵死亡相關因子而實現對高脂血癥模型小鼠肝臟的保護作用，也可降低肝細胞脂質過氧化的發生而減輕肝臟脂質沉積。本研究為臨床防治高脂血癥提供了新思路。

［1］張新，陳文娜.-/-高脂模型小鼠肝臟轉錄組鐵死亡潛在分子網絡互作的初步探討［J］. 重慶醫科大學學報，2021，7（10）：1-6.

Zhang X，Chen WN. A preliminary study on potential molecular network interactions of iron death in the liver transcriptome of-/-high-fat model mice［J］. J Chongqing Med Univ，2021，7（10）：1-6.

［2］王杰，賈連群，宋囡，等. 四君子湯通過鐵死亡途徑改善動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂質沉積［J］. 解剖科學進展，2021，27（1）：75-78.

Wang J，Jia LQ，Song N，et al. Sijunzi decoction improves liver lipid deposition in atherosclerotic mice through ferroptosis pathway［J］. Adv Anat Sci，2021，27（1）：75-78.

［3］ Dixon SJ，Lemberg KM，Lamprecht MR，et al. Ferroptosis： an iron-dependent form of nonapoptotic cell death［J］. Cell，2012，149（5）：1060-1072.

［4］ Xie BS，Wang YQ，Lin Y，et al. Inhibition of ferroptosis attenuates tissue damage and improves long-term outcomes after traumatic brain injury in mice［J］. CNS Neurosci Ther，2019，25（4）：465-475.

［5］ Yan N，Zhang J. Iron metabolism，ferroptosis，and the links with Alzheimer's disease［J］. Front Neurosci，2020，13：1443.

［6］ Li X，Zou Y，Xing J，et al. Pretreatment with roxadustat （FG-4592） attenuates folic acid-induced kidney injury through anti-ferroptosis via Akt/GSK-3β/Nrf2 pathway［J］. Oxid Med Cell Longev，2020，2020：6286984.

［7］ Kobayashi M，Suhara T，Baba Y，et al. Pathological roles of iron in cardiovascular disease［J］. Curr Drug Targets，2018，19（9）：1068-1076.

［8］ Gao M，Monian P，Pan Q，et al. Ferroptosis is an autophagic cell death process［J］. Cell Res，2016，26（9）：1021-1032.

［9］ Tsurusaki S，Tsuchiya Y，Koumura T，et al. Hepatic ferroptosis plays an important role as the trigger for initiating inflammation in nonalcoholic steatohepatitis［J］. Cell Death Dis，2019，10（6）：449.

［10］張和針，王志業，徐江林，等. 加味二至丸對絕經后女性高血壓患者的影響［J］. 廣州中醫藥大學學報，2018，35（3）：392-397.

Zhang HZ，Wang ZY，Xu JL，et al. Effect of modified Erzhi pills on hypertension of postmenopausal women［J］. J Guangzhou Univ Tradit Chin Med，2018，35（3）：392-397.

［11］ 徐進文，許潔安，李潤美，等. 加味二至丸對卵巢切除小鼠的影響［J］. 廣州中醫藥大學學報，2013，30（3）：367-371，443.

Xu JW，Xu JA，Li RM，et al. Effects of modified Erzhi pills on ovariectomized mice［J］. J Guangzhou Univ Tradit Chin Med，2013，30（3）：367-371，443.

［12］ 諸駿仁，高潤霖，趙水平，等. 中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）［J］. 中國循環雜志，2016，31（10）：937-953.

Zhu JR，Gao RL，Zhao SJ，et al. Guidelines for the prevention and treatment of dyslipidemia in adults in China （2016 revision）［J］. Chin Circ J，2016，31（10）：937-953.

［13］ Wang Y，Zhao Y，Wang H，et al. Histone demethylase KDM3B protects against ferroptosis by upregulating SLC7A11［J］. FEBS Open Bio，2020，10（4）：637-643.

［14］ Latunde-Dada GO. Ferroptosis： role of lipid peroxidation，iron and ferritinophagy［J］. Biochim Biophys Acta Gen Subj，2017，1861（8）：1893-1900.

［15］ Xu T，Ding W，Ji X，et al. Molecular mechanisms of ferroptosis and its role in cancer therapy［J］. J Cell Mol Med，2019，23（8）：4900-4912.

［16］ Hassannia B，Vandenabeele P，Berghe TV. Targeting ferroptosis to iron out cancer［J］. Cancer Cell，2019，35（6）：830-849.

［17］ 陳明霞，張恩，劉芳，等. 淫羊藿苷通過調節Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠腎缺血再灌注損傷［J］. 中國免疫學雜志，2020，36（22）：2721-2725.

Chen MX，Zhang E，Liu F，et al. Icariin reduces renal ischemia-reperfusion injury in rats by regulating the Nrf2/HO-1 signaling pathway［J］. Chin J Immunol，2020，36（22）：39-43.

［18］ 李琦，孫貴才. 淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞鐵死亡及向心肌樣細胞分化的影響［J］. 中國組織工程研究，2021，25（13）：1988-1992.

Li Q，Sun GC. The effect of icariin on the iron death and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells［J］. Chin Tissue Eng Res，2021，25（13）：1988-1992.

［19］ 顧聞，劉特，陳久林，等. 特女貞苷對血管內皮細胞氧化損傷的作用研究［J］. 中國中西醫結合雜志，2018，38（9）：1093-1098.

Gu W，Liu T，Chen JL，et al. Study on the effect of special ligustrin on oxidative damage of vascular endothelial cells［J］. Chin J Integr Tradit Chin West Med，2018，38（9）：1093-1098.

［20］ 王雪梅，張建勝，戴云，等. 旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性研究［J］. 時珍國醫國藥，2009，20（2）：356-358.

Wang XM，Zhang JS，Dai Y，et al. Study on extraction of flavone fromand itsantioxidation［J］. Lishizhen Med Mater Med，2009，20（2）：356-358.

［21］ Yang WS，Sri Ramaratnam R，Welsch ME，et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPx4［J］. Cell. 2014，156（2）：317-331.

［22］ Friedmann Angeli JP，Schneider M，Proneth B，et al. Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in mice［J］. Nat Cell Biol. 2014，16（12）：1180-1191.

［23］ Jiang L，Kon N，Li T，et al. Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression［J］. Nature，2015，520：57-62.

［24］ Forcina GC，Dixon SJ. GPX4 at the crossroads of lipid homeostasis and ferroptosis［J］. Proteomics，2019，19（18）：e1800311.

［25］ 梁譯丹，覃王，黃豪，等. 自噬通過降解鐵蛋白促進神經元鐵死亡參與蛛網膜下腔出血后早期腦損傷［J］.第三軍醫大學學報，2019，41（15）：1407-1414.

Liang YD，Qin W，Huang H，et al. Autophagy promotes neuronal iron death by degrading ferritin and participates in early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］. J Third Mil Med Univ，2019，41（15）：1407-1414.

［26］ Hou W，Xie Y，Song X，et al. Autophagy promotes ferroptosis by degradation of ferritin［J］. Autophagy，2016，12：1425-1428.

Jiawei-Erzhi pills attenuate liver lipid deposition in mice with hyperlipidemia by inhibiting ferroptosis

MA Gui-ping1，2，3，YU Zhong-yang4，QING Li-jin1，LI Jun-long1，HONG Chuang-xiong1，2△

（1，510405，；2，510405，；3，，510405，；4，266033，）

To observe the effects of Jiawei-Erzhi pills on liver lipid deposition and ferroptosis-related protein expression in mice with hyperlipidemia.Thirty-/-mice fed with high-fat diet were randomly divided into model，simvastatin，and Jiawei-Erzhi pill groups，with 10 mice in each group. Ten C57BL/6J mice served as normal control group. The corresponding drugs were given intragastrically. The mice in normal control group and model group were given the same volume of normal saline for 10 weeks. The automatic biochemical analyzer was used to measure serum triglyceride （TG），total cholesterol （TC），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） content. HE staining and oil red O staining were applied to observe the morphological changes and lipid deposition of mouse liver tissues. The levels of reduced glutathione （GSH） in liver tissue and serum and iron content in liver tissue were measured by kits. The expression levels of ferroptosis-related factors GPx4，SLC7A11，p53，NOX1，COX2 and FTH1 in liver tissue were detected by RT-qPCR and Western blot.Jiawei-Erzhi pills significantly reduced serum TC，TG and LDL-C，increased the content of HDL-C and GSH （<0.05），and reduced liver iron deposition and lipid droplets. Down-regulation of p53，COX2 and NOX1 mRNA and protein levels （<0.05），and increased SCL7A11，GPx4 and FTH1 levels were observed in Jiawei-Erzhi pill group （<0.05）.Jiawei-Erzhi pills reduce liver lipid deposition in mice with hyperlipidemia by inhibiting liver ferroptosis pathway.

Jiawei-Erzhi pills； Hyperlipidemia； Ferroptosis； Liver lipid deposition； Mice

R589.2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.009

1000-4718（2022）02-0259-08

2021-09-23

2022-01-14

［基金項目］國家自然科學基金項目（No. 81373799）；廣東省中醫藥強省建設指標體系構建研究（No. 20173004）

Tel： 13802763282； E-mail： hongchuangxiong@gzucm.edu.cn

（責任編輯：盧萍，羅森）