微量元素鋅對視網膜衰老及炎癥影響的研究進展

汪水風 邵毅

(南昌大學第一附屬醫院眼科，江西 南昌 330006)

鋅是所有生物所必需的微量營養素，為人體內第二豐富的微量元素〔1〕。人體內只有約0.1%的鋅含量在血漿中。約60%的鋅含量存在于骨骼肌中，30%存在于骨中。鋅在小腸中被吸收，通過皮膚、汗液、腎臟、尿液、大腸或結腸和糞便中排出〔2〕。鋅是唯一缺乏生物氧化還原活性的過渡金屬離子，它充當質子供體，使鋅成為理想的酶促因子〔3，4〕。鋅既可直接參與化學催化，也可通過維持蛋白質結構或穩定性間接參與〔5〕。因此，它在多種生物過程中起著重要的調節作用，作為300多種酶的催化劑和包含在數千種蛋白質中的鋅指結構域〔6，7〕。鋅在DNA合成、RNA轉錄、細胞分裂和活化及在防止細胞凋亡等基本過程中發揮著關鍵作用〔8〕。它在影響細胞功能的信號轉導方面也發揮著重要作用，尤其是對免疫系統的發育和完整性的影響，其影響先天性和適應性免疫應答〔7〕。眼部較其他器官和組織，鋅含量異常高，鋅含量最高的是視網膜色素上皮細胞(RPE)，其次是視網膜〔9，10〕。鋅在眼內其他各組織的含量從多到少的順序為(降序)：睫狀體、虹膜、視神經、鞏膜、角膜、晶狀體〔11〕。本文就鋅對視網膜衰老及炎癥影響的研究進展進行綜述。

1 正常視網膜中的鋅

神經視網膜通過視神經與大腦連接，其血供來源于視網膜中央動脈。小分子(蛋白質和脂質)在視網膜血管的運輸由內皮細胞之間的緊密連接控制，內皮細胞之間的緊密連接構成內部血-視網膜屏障。視桿細胞、視錐細胞和光感受器內段之間的黏附連接稱為外邊緣膜的屏障，將視網膜區域與視網膜下空間隔開。在視網膜下是單層的RPE，它的主要功能是支持視網膜，通過其高色素含量減少光的反向散射，并消除視覺周期產生的代謝物，還可阻止新血管從下面的脈絡膜血管系統生長到視網膜層。RPE和Bruch膜一起形成外部血-視網膜屏障，可防止大分子和免疫細胞從下面的脈絡膜進入光感受器層。位于Bruch膜下方的脈絡膜含有密集的血管網絡(脈絡膜毛細血管)，為RPE、視網膜和視神經提供氧氣和營養。相比之下，Müller細胞(一種特殊形式的局部視網膜膠質細胞)則遍布整個視網膜。作為正常老化過程的一部分，代謝物在視網膜-RPE和RPE-脈絡膜界面中積累。它的提前老化可能導致疾病，如年齡相關性黃斑變性(AMD)。

1.1鋅在視網膜脈絡膜復合體中的分布 視網膜-脈絡膜復合體中含有高濃度的鋅，總細胞鋅濃度約為100 μmol/L〔12〕。大多數細胞內鋅與蛋白質緊密結合，具有高結合親和力，可增加細胞內鋅的利用〔13，14〕。在視網膜組織中，鋅通常儲存在神經節細胞、水平細胞和無長突細胞內。研究證明〔13〕在視網膜Müller細胞內也含有鋅。視網膜神經元的去極化可誘導叢狀層的鋅釋放，這為視網膜中鋅的神經調節劑作用提供了第一個證據〔15〕。從感光體的突觸末端，并通過負反饋谷氨酸內源鋅共同釋放時，減少鈣和谷氨酸的結合，伴隨囊泡將谷氨酸釋放到細胞外。因此，這可能保護視網膜免受谷氨酸興奮毒性〔16〕。

1.2鋅在視網膜脈絡膜復合體中發病機制 除了存在于細胞器中之外，細胞內鋅存在于光感受器的外段〔14〕，其中鋅的作用主要依賴于光的暗適應。事實上，鋅可能通過穩定視紫紅質來穩定外段的膜。然而，額外低親和力鋅與特定組氨酸位點的結合也會導致視紫紅質的去穩定化〔16〕，并降低熱穩定性，表明視紫紅質可能在光照下比在黑暗中更不穩定，這種鋅誘導的視紫紅質去穩定化可能與遺傳性視網膜疾病相關。值得注意的是，視網膜色素變性與系統性鋅缺乏有關。維生素A對維持視網膜暗適應功能極其重要，光感受器外段中的鋅含量也可影響鋅依賴性醇脫氫酶的活性，從而影響視網膜中維生素A的轉化〔17〕。通過影響肝臟中維生素A結合蛋白的合成或釋放，鋅也可能參與暗適應。鋅是維生素A代謝的重要金屬離子。鋅通過參加視黃醛結合蛋白的生物合成和維生素A醇向維生素A醛的轉化，以調控維生素A的代謝，維持視網膜視桿細胞的功能。視黃醛、維生素A相互轉化的過程中，需要乙醇脫氫酶和視黃醛還原酶的參與，而鋅正是這兩種酶的重要金屬離子。

事實上，疾病時鋅元素分布中RPE層中的鋅首先減少〔9〕。RPE色素沉著作為黑色素合成和黑素體的形成似乎是由鋅來調節〔9〕。黃斑區的鋅含量可能比周圍性視網膜色素上皮少，并認為黃斑區鋅水平可能進一步受老化的影響。Bruch膜含有大量的鋅，特別是在患有AMD的眼中。眼部脈絡膜鋅濃度含量最高〔10〕。由于脈絡膜是高度著色層，所以可能是色素鋅促成了這種富集。結合鋅和脈絡膜色素的證據提示了鋅、脈絡膜色素和脈絡膜視網膜炎癥之間的可能存在關系，由于AMD的RPE功能障礙，鋅的積累和源自脈絡膜色素的抗原的暴露可能導致視網膜炎癥。然而，目前人們對鋅在脈絡膜中的作用和功能及其與炎癥的關系知之甚少，除了鋅隨著年齡的增長而積累外〔10〕，其也可促進老化眼睛內層中的鋅缺乏的發展〔18〕。 根據了解到的鋅、炎癥和免疫之間的關系，考慮可能與視網膜炎癥有關。

2 鋅對衰老視網膜的影響

生物體內的氧自由基水平位隨年齡增長而不斷積累，造成機體組織的老化，體內依賴消除氧自由基的酶如超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)等和維生素A、E、C等抗自由基物質來調節自由基代謝的平衡，微量元素鋅是某些酶的主要構成成分，可以穩定脂蛋白的結構與性質，并具有發揮酶的催化功能。

2.1AMD 在發達國家，高達30%的老年人缺鋅，并且已經認識到鋅可能在衰老的退行性疾病中起重要作用，作為抗氧化途徑的調節劑和抗炎劑〔19〕。視網膜老化，特別是視網膜中央黃斑區，被認為是影響視力的最重要的部位之一。尤其AMD影響了大約1/4的65歲以上的人〔20〕。AMD的特征性病變是脈絡膜和RPE之間存在玻璃體疣。臨床上，玻璃體疣用于監測視力喪失的進展，因為其他類型的沉積物不易觀察。研究發現，小玻璃膜疣可能并不總是與視力喪失的風險相關。然而，位于黃斑區域的多個大玻璃疣會增加AMD的風險。除了蛋白質和脂質，玻璃疣含有鋅的異常沉積，其中一些是可更換(離子或松散結合的蛋白質)的形式存在〔14〕。隨著年齡增長，玻璃體疣的積累后又通過RPE扭曲和破裂并推入神經視網膜的能力。因此，亞RPE沉積物形成的發展和進展可能是AMD發病機制中的關鍵因素。

干性AMD可分為早期、中期和晚期。RPE細胞的體外研究證實，隨著年齡的增加，內源性鋅水平降低，并且RPE基底側局部化的鋅2和鋅4隨著年齡的增加而降低〔4〕。Newsome等〔18〕研究表明在有AMD癥狀的人眼中鋅的水平降低。大鼠中光誘導的視網膜變性和視細胞損傷導致與炎癥、細胞凋亡、細胞因子產生和先天免疫反應相關的基因表達變化，這些途徑可通過補鋅，結合年齡相關眼病研究(AREDS)抗氧化補充劑配方和其他抗氧化劑來抑制〔21，22〕。RPE中鋅的變化可能在AMD的發展中起著多重作用。RPE的功能是富含鋅的光感受器外部區段的吞噬作用和加工，潛在地進一步豐富RPE內鋅含量。由于RPE損傷被認為是AMD發展和進展的前兆〔20〕，因此RPE的異常鋅釋放可能由于上述損害而發生。脈絡膜也含有豐富的鋅，與AMD相關的變化〔23〕也可能導致Bruch膜中鋅的積累。表明Bruch膜中的緩沖鋅在調節亞RPE沉積物形成和AMD的發展中可能起著重要的作用。

2.2鋅和AMD的臨床研究 一項針對日劑量硫酸鋅(100 mg)與安慰劑相比的隨機對照試驗的單中心研究顯示〔24〕，與基線相比，較安慰劑組視敏度變化具有顯著的陽性治療效果，最終視力下降的可能性降低。因此，那種認為通過飲食補充或恢復平衡的鋅可防止AMD提供了一個有趣的和潛在的廉價的干預策略和后續的臨床試驗。在AREDS2中添加葉黃素類胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質，添加或不添加omega-3脂肪酸，表明這些成分可能有助于防止AMD進展和相關的視力喪失〔6〕。研究表明，補充鋅與AREDS配方和其他抗氧化劑聯合使用可抑制視網膜退行性通路〔22〕。與AREDS同時，一項基于人群的隊列研究表明〔25〕，鋅的攝入量高于維生素E、C和胡蘿卜素的中位數，與降低35%AMD事件風險有關。另一項研究進一步證實了這一點〔26〕，較高的膳食鋅攝入對AMD事件有良好的影響。

補鋅的效果可根據遺傳背景確定。有研究顯示，鋅營養對早期攜帶高補體因子H基因(CFH)遺傳風險變異的AMD患者有益〔27〕。進行ARDS研究的患者僅攜帶與年齡相關的黃斑病變敏感性(ARMs)2風險等位基因，而不是CFH，從含鋅ARDS配方中獲得最大獲益〔28〕。此外，鋅補充試驗和流行病學研究之間存在一些相互矛盾的結果。因此，需要進一步研究鋅在AMD發病中的作用。

2.3AMD的鋅和補體 由于該CFH多態性(在已知結合肝素和C-反應蛋白的區域)被發現與AMD密切相關，先天免疫的補體成分在AMD的發病機制中起重要作用。CFH與單核吞噬細胞的結合抑制了CD47介導的小鼠視網膜模型系統固有免疫細胞的消除〔29〕。因此，CFH突變體的存在可能抑制由巨噬細胞驅動的CD47介導的視網膜炎癥的消退，并破壞視網膜下空間的穩態。CFH及其Tyr402突變體可能與鋅、亞RPE沉積形成和AMD有關〔30〕。在高于20 μmol/L鋅濃度水平下，CFH在試管中形成大的低聚體在200 μmol/L鋅濃度水平下，超過85%的CFH是低聚體，并處于完全抑制狀態，因此本文推測在AMD患者的Bruch膜也會發生類似的低聚化。研究已經表明，CFH的失活和旁路C3的不受控制的激活導致繼發性C3缺乏，是導致AMD的病理過程的一部分。此外，Hageman等〔30〕研究表明，CFH與C3b/iC3b，膜攻擊復合物和C5b-9是亞RPE沉積物的成分。因此，從RPE中釋放異常高水平的鋅會對其產生損傷，并且如上所述，Bruch膜在AMD中含有高濃度鋅〔16〕。作為低聚CFH將具有減弱補體抑制劑的功能，RPE和脈絡膜將面臨替代通路介導的補體攻擊的持續風險。在補體系統中，鋅可能不僅僅影響CFH，可與許多補體蛋白結合并以幾種不同的方式影響補體活性。以上這些數據似乎支持補體介導的炎癥是AMD的主要病理驅動因素〔30〕。

3 鋅對視網膜炎癥的影響

3.1鋅的抗炎機制 鋅作為體液免疫和細胞免疫的調節劑，還可起到抗炎的作用。鋅對免疫系統的先天和適應性的發育和維持至關重要，因此在炎癥的調節中起關鍵作用。已知衰老會影響老年人的免疫功能，主要是以T細胞介導的免疫反應為特征的適應性免疫，這些變化被稱為免疫衰老。免疫衰老可能導致免疫失調，從而導致促炎細胞因子的產生，這種狀態被稱為炎性衰老〔31〕。 關于細胞免疫，缺鋅和補鋅都對T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞和巨噬細胞的發育和功能具有重要作用。鋅對T細胞的細胞因子信號傳導和T細胞活化誘導的細胞死亡特別是與年齡相關的影響已被觀察到，其可在體外通過鋅進行調節〔31〕。

眾所周知，幾乎所有與年齡相關的退行性疾病都涉及慢性炎癥，包括發生在免疫耐受組織中，如視網膜和大腦。眼睛免疫耐受失敗可導致典型的自身免疫型炎癥，表現為葡萄膜炎的炎性疾病。對老年人補鋅的研究表明，補充這一人群的鋅缺乏癥可降低感染發生率和炎癥細胞因子的產生〔19〕。已顯示自身免疫性眼色素層炎中的炎癥由Th1和Th17 T細胞亞群介導，并且可被調節T細胞(Treg)抑制〔32〕。胸腺來源和外周誘導的Treg是抑制自身反應性T細胞和其他內源性炎癥來源的重要生理免疫機制。在實驗自身免疫性腦炎(EAE)的小鼠模型，減少體內實驗鋅給藥，降低的Th17細胞維A酸孤兒受體γT細胞和顯著增加誘導型調節性T細胞〔33〕。因此，有學者提出補鋅能通過增加Treg細胞活性誘導不需要的免疫反應中的耐受性，并且已經提出鋅作為治療自身免疫炎癥的工具，而不抑制整個免疫系統〔33〕。

3.2鋅在視網膜炎癥中的作用 輕度缺鋅在老年人中很常見，其特征是隨著年齡的增長，血清或血漿鋅水平下降〔34〕。使用體外細胞培養系統和老年小鼠模型確定鋅缺乏和年齡對炎癥反應誘導的影響的研究表明，鋅缺乏，特別是免疫細胞中細胞內鋅的減少，與年齡增加的炎癥反應有關，研究表明通過膳食補充劑恢復鋅的狀態可減少老年人相關的炎癥〔35〕。 在衰老的眼睛中，特別是在RPE的水平上，存在氧化應激產物的積累，如活性氧(ROS)，其進一步驅動氧化應激，并且可能改變RPE的代謝〔36〕。ROS是由光感受器外部區段的吞噬作用產生的視覺循環的副產物，或來源于眼內特有的光氧化應激的環境，可以促進視網膜中氧化應激引起的病理性炎癥活動。

免疫細胞和組織支持的間質細胞，如視網膜和脈絡膜中的RPE和小膠質細胞，都能夠控制和抵抗免疫反應，并且有人認為在視網膜老化中這些細胞可能是炎癥的關鍵介質〔36〕。巨噬細胞和樹突細胞通常不存在于視網膜中，而是存在于下面的脈絡膜中。免疫細胞從下面的脈絡膜或從體循環進入視網膜進行調節〔37〕。因此，氧化損傷可能是AMD的一個初始誘因，而這種生理應激的增加可能會激活固有的免疫細胞，進一步導致細胞和組織損傷，從而導致功能的喪失。小膠質細胞可能在視網膜下空間積聚，有益于炎癥損傷的癥狀和對損傷的反應，但在AMD中，亞RPE空間中細胞和代謝廢物的積累加劇了與年齡相關的變性的進展〔36，37〕。巨噬細胞在AMD發病機制中也起著重要作用。巨噬細胞是在RPE萎縮、Bruch膜的破裂和脈絡膜新血管形成的作用相似〔38〕。隨著老化的視網膜細胞損傷和氧化應激的積累，巨噬細胞可能變得負擔過重，而且其在衰老過程中逐漸喪失吞噬能力〔38〕。眾所周知，鋅的缺乏會對巨噬細胞功能產生不利影響，導致吞噬作用和細胞因子產生的失調，這些均支持了鋅的局部有效性可能影響由駐留免疫細胞驅動的視網膜炎癥水平。視網膜炎癥可能具有類似的巨噬細胞對鋅穩態和ROS產生的影響。

4 鋅和微生物

鋅可通過其對腸道中的微生物組和免疫細胞的影響間接影響視網膜炎癥。人體免疫系統與居住在人體腸道的微生物具有高度共同進化的關系，從而維持宿主和常駐微生物之間的體內平衡〔39〕。鋅與腸道細菌的關系，在胃腸免疫系統功能與整個生命健康和疾病中發揮重要作用〔39〕。“破壞宿主微生物體內平衡的微生物群結構和(或)功能的不平衡”，是許多非傳染性炎性疾病的新興特征。如果視網膜副炎癥發展成慢性視網膜病變，并構成在正常體內平衡的移位，以適應AMD的新的生理或代謝條件下(如在許多其他慢性炎性疾病狀態發生時)，在中斷營養，微生物組和宿主代謝之間的相互關系可能是破壞正常體內平衡的關鍵因素。因此，該微生物群群落的組成決定了部分感染和易感性抗炎性疾病的水平。

腸道中的營養鋅，通過與腸道微生物群的直接相互作用或通過腸黏膜中駐留T細胞的影響可能會導致全身性炎癥，并因此刺激局部視網膜炎癥的免疫細胞。鋅對大多數生物(包括許多細菌)的生長至關重要，這些生物需要吸收鋅才能生長。過量的飲食鋅顯著改變腸道微生物菌群，在梭狀芽孢桿菌等致病菌的殖民環境中，通過增加毒素活性和改變宿主的免疫反應，可能會加重梭狀芽孢桿菌相關疾病。這些發現表明〔40〕，微生物組的組成可作為一種潛在的工具，以預后和診斷炎癥的身體部位遠至腸道。

5 鋅補充的潛在風險和未來方向

人體內沒有專門的鋅儲存系統，所以需要每天攝入足夠的鋅，以達到適當的免疫功能的穩定狀態。在英國，建議的每日鋅攝入量(參考營養素攝入量)成年男性為9.5 mg，成年女性為7.0 mg〔21〕。英國食品標準局和英國衛生部建議，鋅的攝入量不應超過每天25 mg，但通常人們服用的鋅補充劑>80 mg/d。歐洲食品安全局(EFSA)2009年小組報告指出，鋅的膳食攝入與以下生物功能建立了因果關系：免疫系統的正常功能；正常的DNA合成和細胞分裂；保護DNA，蛋白質和脂質免受氧化損傷；維持正常骨骼；正常的認知功能；正常的生育和繁殖；脂肪酸的正常代謝；正常的酸堿代謝；正常的維生素A代謝和維持正常視力〔3〕。

5.1鋅缺乏的臨床表現 由于營養不良，經常發生鋅缺乏癥，特別是在老年人中。1961年首次從伊朗報道了一種懷疑為鋅缺乏癥繼發的臨床綜合征，包括生長遲緩、男性性腺功能減退、皮膚變化、精神萎靡、肝脾腫大、鐵缺乏性貧血和食土癖〔41〕。關于鋅缺乏對視覺功能的影響，通過觀察到補鋅改善了酒精性肝病(肝硬化)患者的異常視覺暗適應，其機理可能是鋅對肝臟中維生素A結合蛋白的合成或釋放的影響。在一系列鐮狀細胞貧血患者和健康的人類受試者中也進行了類似的鋅和暗適應的臨床觀察，表明這些對視覺功能的影響可能與飲食中鋅缺乏有關。越來越多的研究表明〔22〕，飲食會影響局部視網膜鋅的穩態。鋅的補充可導致細胞內視網膜鋅的含量更高，而鋅缺乏的飲食誘導視網膜基因表達變化。光誘導的大鼠視網膜變性和視細胞損失導致基因水平的變化(歸因于炎癥、細胞凋亡、細胞因子、先天免疫反應及相關的受體)，并且這種類型誘導的視網膜退化性變化在氧化鋅抗氧化劑的處理下呈現減少趨勢。如前所述，視紫紅質的鋅誘導去穩定化可能是遺傳性基因視網膜疾病，如視網膜色素變性，其也與全身缺鋅相關聯。

5.2鋅過量的風險 生理條件下，童年和懷孕期間對鋅的需求增加。鋅吸收抑制劑是導致缺鋅的最常見原因〔5〕，植酸鹽存在于以碳水化合物為主要成分的食品中，對復合膳食上鋅的吸收有強烈的抑制作用。因此，在任何群體中，從嚴重的病例到微量缺乏癥和次優狀態〔5〕，缺鋅被認為發生在一個范圍內，并且可能是飲食攝入和吸收的繼發性疾病。高劑量的鋅膳食補充已被證明會干擾膳食銅和鐵的吸收。此外，雖然鋅是炎癥和免疫功能的重要調節因子，但其也可以抑制免疫系統，增加某些癌癥的風險，包括轉移性前列腺癌〔1〕。營養鋅補充，存在潛在的安全風險，除了對療效的問題，在AMD的背景下，導致了新公共衛生的利益和研究，主要集中在健康均衡的飲食成分和飲食模式，需要提供必要的維生素和微量營養素，以獲得最佳的視覺和身體功能〔25〕。除了通過膳食補充鋅來增加鋅攝入量之外，通過改善可利用膳食鋅的吸收來優化膳食鋅攝入，例如通過最大程度降低肌醇六磷酸對鋅吸收的影響。

綜上，為了使鋅營養科學的臨床轉化能夠取得進展，需要開發有效、可靠和可行的生物標志物及用于測量鋅狀態的替代終點，如視網膜暗適應，以用于未來的臨床研究。