miR-1285-3p在腦動脈瘤中對金屬基質蛋白酶-13的作用

賈帥 丁新民

(山西醫科大學附屬人民醫院神經外科，山西 太原 030000)

腦動脈瘤(CA)起源于顱內動脈血管壁部分區域的病理性膨脹〔1〕，是引發蛛網膜下腔出血的首要因素〔2〕，蛛網膜下腔出血發作時進展相當快，患者的致殘率與致死率居高不下，患者的預后生活質量不高。對腦動脈瘤的病理學研究得知，該病的進展包括原有血管擴張、通透性增加、細胞外基質的降解、內皮細胞增生、遷移等多個過程，其中細胞外基質(ECM)降解是病程進展的關鍵一步〔3〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)分布在細胞外基質中，負責降解彈性蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白與蛋白多糖等蛋白質〔4〕。在一些關于癌癥的研究中已證實MMPs的異常表達與癌細胞的侵襲與遷移相關，而血管平滑肌細胞的遷移與膠原蛋白的降解極易誘發動脈瘤病程加速，并且對部分腦動脈瘤患者進行研究，其瘤壁組織與血漿中的MMPs表達水平比正常組織與血漿顯著上調〔5〕。而有研究指出，miR-1285-3p可作為潛在的抑癌因子發揮抑癌作用〔6〕。本研究旨在探究miR-1285-3p在腦動脈瘤對MMP-13的調控作用與相互關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 從2018年4月至2019年4月山西醫科大學附屬人民醫院手術的腦動脈瘤患者中，隨機選擇17例患者作為研究組，其中男9例，女8例，年齡41～67歲，平均(56.27±7.19)歲，經數字減影響血管造影技術(DSA)確診為腦動脈瘤，按瘤體直徑對患者分類，小動脈瘤(直徑<1.0 cm)11例，大動脈瘤(1.0≤直徑<2.5 cm)5例，巨大動脈瘤(直徑≥2.5 cm)1例〔7〕。依據病變部位對患者分類，頸內動脈瘤3例，前交通動脈瘤4例，大腦中動脈瘤6例，后交通動脈動脈瘤4例〔8〕。依據Hunt-Hess分級，Ⅰ、Ⅱ級患者12例，≥Ⅲ級患者5例〔9〕。另隨機選擇同期來山西醫科大學附屬醫人民醫院手術治療的非血管性腦部疾病患者共19例作為對照組，其中腦外傷11例，腦腫瘤8例，收集其顳淺動脈組織。其中男8例，女11例，患者42～74歲，平均(58.25±6.94)歲。排除標準：既往有高血壓和(或)高血脂病史者。入選患者知情并同意本研究內容。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，本研究經過醫院倫理委員會批準。

1.2方法 對照組組織標本取自手術入路時經過的顳淺動脈。研究組組織標本取自術中夾閉動脈瘤后切除的部分瘤體組織。用焦碳酸二酯(DEPC)清洗組織表面的血液后，一部分組織放入錫紙做的樣品槽中，應用最佳切割溫度(OCT)將組織包埋后在液氮中凍存，低溫切片，進行免疫組化與蘇木素-伊紅(HE)染色；另一部分組織用于提取收集組織中的總RNA與蛋白。

1.3組織總RNA的提取與RT-PCR檢測 采用TRNzol試劑盒(tiangen公司，貨號DP121221)提取總RNA。用nanodrop檢測RNA A260/280值≥1.8時，用反轉錄試劑盒(tiangen公司，貨號KR106)將去除gDNA的RNA反轉錄成cDNA，作為RT-PCR模板，應用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(tiangen，FP205)試劑盒檢測miR-1285-3p、MMP-13與MCP-1 mRNA的表達水平。使用2-ΔΔCt法對結果進行分析〔9〕。

1.4免疫組織化學的方法檢測兩組組織中MMP-13、CD68、細胞間黏附因子(ICAM)-1和NF-κB的表達水平 抗體均來自Abcam，貨號ab39012、ab125212、ab2213、ab28856。將液氮冰凍好的組織塊進行冰凍切片，切片在-20℃中冷凍一夜固定組織，-20℃丙酮固定10 min；洗第一次時，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復浸濕幾次，使溫度平衡，PBS清洗3次，每次5 min；0.3% Triton X-100通透20 min；PBS清洗3次，每次5 min；3%H2O2浸泡20 min，去除內源性過氧化氫酶；PBS清洗3次，每次5 min；5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉30 min；配制一抗工作液，4℃孵育過夜；PBS清洗3次，每次5 min；配制二抗工作液，室溫孵育1 h；PBS清洗3次，每次5 min；室溫下二氨基聯苯胺(DAB)顯色2～3 min，邊染色、邊鏡檢，正常顯色后終止染色；自來水輕輕沖洗玻片，沖洗10 min；蘇木精復染約20 s，之后用自來水沖洗10 min，終止染色；分化3 s；用75%、85%、95%、100%(2遍)酒精逐級脫水，每級5 min；用兩級二甲苯透明，每級5 min；中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結果；光學顯微鏡下觀察拍照、記錄。

1.5HE染色方法觀察兩組組織的血管形態 -20℃丙酮固定10 min，用PBS反復浸濕幾次，使溫度平衡，PBS清洗3次，每次5 min，蘇木精染色30～60 s，之后用自來水沖洗，終止染色；伊紅染色30～60 s，邊染色邊觀察，之后用自來水沖洗，終止染色；用75%、85%、95%、100%酒精逐級脫水，每級5 min；用兩級二甲苯透明，每級5 min；中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結果；觀察拍照、記錄。

1.6Western印跡檢測MMP-13與MCP-1蛋白的表達 MCP-1 抗體來自Abcam公司，貨號ab9669。將組織塊加入放射性免疫沉淀(RIPA)裂解液后磨碎，冰上靜置30 min后以4℃、1 000 r /min的轉速離心10 min，取上清。用酶標儀檢測蛋白樣品的濃度后，取適量蛋白，加入溴酚藍與RIPA，煮沸7 min，將蛋白樣品徹底變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束后，將MMP-13與MCP-1蛋白與內參β-actin所在的條帶切下并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉90 min后，加入相應的一抗(抗體：脫脂奶粉=1∶2 000)孵育過夜。次日上午用1×TBST徹底洗滌過后再加入相應的二抗(抗體：脫脂奶粉=1∶5 000)，室溫反應1 h，然后1×TBST洗滌，用ECL顯色液顯色。

1.7觀察指標 免疫組化陽性表達的評定方法：當標記分子進入細胞質且能夠看到棕黃色顆粒時，視為陽性表達，依據陽性細胞數比例和染色強度參考相關半定量評分標準：(1)依據陽性細胞所占比例區分：沒有陽性細胞計0分；陽性細胞所占比例低于30%計1分；陽性細胞高于30%計2分。(2)依據著色情況區分：沒有著色計0分；表現為淡黃色計1分；表現為棕黃色計2分；表現為棕褐色計3分。計算以上所得評分的乘積，若為0～1分，則為-；若為2～4分，則為+；若為5～6分，則為；其中陽性表示為+及〔9〕。

1.8統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1兩組組織形態的觀察 研究組瘤壁組織較對照組變薄且向外膨出，內皮細胞空泡狀，部分內皮細胞脫落進入血管腔中游離，可見血栓形成，內膜彈力板變薄或突然間斷，平滑肌數目顯著降低，中膜和外膜有大量炎性細胞浸潤，整個組織的動脈壁厚度不均一，局部區域顯著變薄，見圖1、2。

圖1 對照組正常顳淺動脈組織HE染色(×200)

圖2 研究組腦動脈瘤瘤壁組織HE染色(×400)

2.2兩組組織中MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB陽性表達水平對比 MMP-13、CD68在瘤壁組織中均有表達而ICAM-1和NF-κB主要表達在炎性細胞與血管內皮細胞中，研究組MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB陽性表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表1、圖3。

表1 兩組組織中MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB陽性表達對比

圖3 兩組血管壁組織中MMP-13、CD68、ICAM-1、NF-κB陽性表達

2.3兩組檢測miR-1285-3p、MMP-13與MCP-1 mRNA及蛋白表達水平的對比 研究組miR-1285-3p mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，MMP-13、MCP-1 mRNA及蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表2、表3、圖4、5。

表2 兩組檢測miR-1285-3p、MMP-13與MCP-1 mRNA表達水平的對比

表3 兩組組織中MMP-13與MCP-1蛋白表達水平比較

圖4 兩組組織中MMP-13蛋白表達

圖5 兩組組織中MCP-1蛋白表達水平

3 討 論

microRNA(miRNA)是一種真核生物細胞內源性的短RNA分子,長約20 bp。雖然miRNA不直接編碼蛋白，但可以通過直接作用于靶mRNA，也可以與靶mRNA上3'端的非翻譯區相互結合，以這兩種方式來調控基因在轉錄后的水平〔12〕。

早年對CA的研究認為是血流不斷沖擊腦血管、中膜平滑肌層和彈力纖維受損引起疾病發生〔13〕，近些年更深層的研究發現，動脈瘤壁呈現平滑肌變形、炎性細胞浸潤、ECM膠原纖維排列雜亂〔14〕。研究發現，動脈瘤瘤壁內所有的炎性細胞均過量分泌MMPs，破壞細胞ECM、彈性蛋白及膠原蛋白，破壞正常的血管結構〔15〕。正常生理狀態下MMPs能降解所有已知細胞外基質組分，維持ECM動態平衡。本研究結果表明MMP-13分布在腦動脈血管的各層結構中。

MCP-1又稱單核細胞趨化蛋白，催化單核細胞遷移并分化成巨噬細胞，在炎癥反應中扮演重要角色〔16〕。本研究進一步驗證了炎癥反應促進了CA的發生。

在CA的發病機制研究中，認為顱內動脈的分支處由于血流的沖擊等多種動力學因素易發生損傷，在多種機制的調控下，血管內皮受損處觸發炎癥反應，炎性細胞釋放炎性因子與MMPs，破壞動脈基質，血管重構，動脈血管壁不再完整，瘤體膨出，CA發病〔17〕。CA患者組織中的低miR-1285-3p表達水平促進了MMP-13表達從而促進CA的發生，提示通過維持miR-1285-3p水平能夠抑制MMP-13表達，為CA的治療提供嶄新的思路與實驗基礎。