Fscn1基因在NSCLC中的表達、生物學功能信號通路富集及其與患者預后的關系

任敬 陳謙 許建新 楊新宇 吳琦

(天津市泰達醫院 1呼吸內科，天津 300457；2神經外科；3天津醫科大學總醫院神經外科；4天津大學海河醫院呼吸與危重癥醫學科)

肺癌是臨床上最為常見的惡性實體腫瘤，其發病率在男性為第一位，女性為第二位，且死亡率位居所有腫瘤的第一位〔1〕。根據病理類型，肺癌大體分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌的80%〔2〕。大部分NSCLC患者就診時已發展為晚期或局部晚期，失去根治手術的時機因而預后較差。然而，NSCLC的發病機制仍然不明，其患者預后相關因素并不完全清楚。近年來隨著高通量測序等分子生物技術的不斷發展，從分子角度探尋NSCLC發病機制及預后相關生物學標志物成為研究熱點。肌動蛋白結合蛋白(Fscn)1基因定位于人7號染色體，其生物學功能主要與細胞遷移有關〔3〕。Fscn1基因編碼蛋白在人多種實體腫瘤組織中呈現高表達，如腸癌、肝癌、前列腺癌等，并與患者的臨床病理特征存在一定的關系〔4～6〕。但Fscn1基因在NSCLC中的表達、生物學功能及其與患者預后關系研究鮮有報道。本研究主要探討Fscn1基因在NSCLC中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1Fscn1基因mRNA在腫瘤及對應正常組織中的表達 在人類腫瘤基因組(TCGA)數據庫中檢索“肺癌”“非小細胞肺癌”和“Fscn1基因”，檢索物種為人類，比較多種人腫瘤組織和對應正常組織中Fscn1基因mRNA的表達水平，存在差異的條件為基因差異表達大于2倍(|Log2FC|>1)，P<0.05〔7〕。

1.2功能富集和蛋白網絡分析 采用基因本體論(GO)對Fscn1基因和相關蛋白進行功能富集，包括細胞組分、分子功能和生物學過程3個層面〔8〕。同時利用STRING數據庫構建相互作用蛋白網絡構建條件為置信度大于0.5〔9〕。

1.3生存分析 根據Fscn1基因在NSCLC患者癌組織中表達的中位數，分為高、低表達組，分別計算高、低表達組生存期并繪制生存曲線(Kaplan-Meier)，采用Log-Rank檢驗分析比較高、低表達組與患者預后的關系。比較總生存期(OS)和無疾病進展生存期(DFS)在Fscn1基因高低表達組間是否存在差異。

1.4免疫組織化學法 回顧性分析天津市泰達醫院收治的NSCLC患者51例，采用免疫組織化學法檢測患者手術標本中NSCLC患者癌組織和癌旁正常組織中Fscn1基因編碼蛋白表達水平，分析比較Fscn1基因編碼蛋白表達與患者臨床病理特征的關系。免疫組織化學檢測Fscn1基因編碼蛋白表達按試劑盒操作說明進行。在高倍鏡下隨機選取5個視野，根據著色強弱和陽性細胞比例綜合判定Fscn1表達強度。按色強度評分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；按照每高倍鏡(SP，×200)下陽性細胞所占的比例分為<10%(0分)、10%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)及>75%(4分)。總體評分值=陽性細胞比例評分×染色強度評分；最終評判：<6分為低表達，≥6分為高表達。低表達率(%)=低表達例數/總例數×100%。高表達率=高表達例數/總例數×100%。

1.5統計分析 應用STATA12.0統計軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Log-Rank檢驗。

2 結 果

2.1Fscn1在NSCLC和其他腫瘤中的表達 與正常肺組織比較，Fscn1基因mRNA在多種腫瘤中表達水平明顯升高，見圖1A；在肺鱗癌患者中，癌組織中Fscn1基因mRNA表達水平顯著高于正常肺組織(P<0.05)，見圖1B；進一步分析顯示，NSCLC不同臨床分期患者Fscn1基因mRNA表達水平存在明顯差異 (P<0.05)，見圖1c。

1)P<0.05A:Fscn1基因mRNA在多種腫瘤及對應正常組織中的表達；B Fscn1基因mRNA在肺腺癌和鱗癌及對應正常組織中的表達；C:Fscn1基因mRNA表達與NSCLC患者臨床分期的關系BLCA:膀胱尿路上皮癌；BRCA:乳腺浸潤癌；CESC:宮頸鱗癌和腺癌；CHOL:膽管癌；COAD:結腸癌；ESCA:食管癌；GBM:多形成性膠質細胞瘤；HNSC:頭頸鱗狀細胞癌；KICH:腎嫌色細胞癌；KIRC:腎透明細胞癌；KIRP:腎乳頭狀細胞癌；LIHC:肝細胞肝癌；LUAD:肺腺癌；LUSC:肺鱗癌；PAAD:胰腺癌；PRAD:前列腺癌；PCPG:嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤；READ:直腸腺癌；SARC:肉瘤；SKCM:皮膚黑色素瘤；THCA:甲狀腺癌；THYM:胸腺癌；STAD:胃癌；UCEC:子宮內膜癌圖1 Fscn1基因mRNA在NSCLC和其他腫瘤中表達

2.2Fscn1基因編碼蛋白相互作用網絡 與Fscn1基因編碼蛋白相互作用較為緊密的蛋白網絡共有節點數共51個，相互作用關系446個，區域聚類指數為0.75，蛋白相互作用網絡富集顯著(P<0.05)。見圖2。

圖2 與Fscn1蛋白相互作用網絡

2.3功能富集

2.3.1Fscn1基因生物學過程富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白生物學過程主要富集于核小體組裝，間充質細胞遷移和胸腺細胞凋亡等，見圖3。

圖3 生物學過程富集氣泡圖

2.3.2Fscn1基因細胞成分富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白細胞主要富集于核小體、肌球蛋白束和肌動蛋白等，見圖4。

圖4 細胞成分富集氣泡圖

2.3.3Fscn1基因分子功能富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白細胞主要富集于 ATP酶活性、黏附鏈接、蛋白結合等，見圖5。

圖5 分子功能富集氣泡圖

2.3.4Fscn1基因相關信號通路富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白KEGG信號通路主要富集于細胞間緊密連接、胰腺腫瘤和上皮細胞侵襲等，見圖6。

圖6 KEGG信號通路富集氣泡圖

2.4相關分析 相關性分析顯示，Fscn1基因正相關表達最顯著的基因為SPHK1基因(r=0.53);于Fscn1基因負相關表達最顯著的基因為跨膜蛋白(TMEM)125(r=-0.38)，見圖7。

A:正相關表達基因SPHK1;B:負相關表達基因TMEM125 圖7 Fscn1基因相關表達基因散點圖

2.5生存分析 根據Fscn1基因mRNA在NSCLC患者癌組織中表達的中位數分為高低表達組，生存分析顯示高低表達組總生存(HR=1.3,P<0.05)顯著低于低表達組；但高低表達組患者無疾病進展生存無明顯差異(HR=0.82,P>0.05)，見圖8。

圖8 Fscn1 mRNA在NSCLC患者中表達與患者生存期關系

進一步根據病理類型分為鱗癌和腺癌，結果顯示肺腺癌中，Fscn1基因mRNA高表達患者總生存期顯著低于低表達者(HR=1.6,P<0.05)。

2.6Fscn1基因編碼蛋白表達情況 Fscn1基因編碼蛋白主要表達于肺癌細胞胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒狀，彌漫分布于細胞膜及細胞包質內。Fscn1基因編碼蛋白在NSCLC患者癌和癌旁組織中的陽性表達率分別為70.6%(36/51)和17.6%(9/51)。Fscn1基因編碼蛋白在NSCLC患者癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

2.7Fscn1基因編碼蛋白表達與NSCLC患者臨床病理特征關系 Fscn1基因編碼蛋白在癌組織中的陽性表達與NSCLC患者的臨床分期(P<0.05)和縱隔淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1。

表1 Fscn1基因編碼蛋白表達與NSCLC患者臨床病理特征關系(n)

3 討 論

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤，2018年北美肺癌發病人數23萬人，死亡人數為15萬人〔10〕。在我國，肺癌是導致居民死亡的重要原因之一，每年因肺癌死亡的人數高達數十萬人，肺癌早期起病隱匿，往往在診斷時處于轉移性Ⅳ期并伴有遠處器官的轉移，這導致了患者總生存期縮短，其中腦轉移占很大比例〔11〕。然而肺癌的發病原因目前仍未完全明了，大多數研究認為與患者的遺傳背景和后天環境因素有關。遺傳背景包括惡性腫瘤家族史、某些代謝酶基因多態性等〔12〕，后天因素主要與吸煙、環境污染等因素有關。但肺癌發生的機制十分復雜，其確切發病分子機制仍不完全明了。近年來隨著高通量測序等分子生物技術的不斷發展，從分子角度探尋NSCLC發病機制及預后相關生物學標志物成為研究熱點。

有文獻報道Fscn1基因編碼蛋白在多種實體腫瘤組織中呈現高表達，如結直腸癌、肝癌、旁觀愛等，并與患者的臨床病理特征和預后存在一定的關系〔6〕。Fscn1基因編碼蛋白是一種細胞骨架蛋白，該基因主要是與F-肌動蛋白結合，并將其組裝成平行排列的肌動蛋白束，是調節細胞運動的關鍵基因之一〔13〕。人類的Fascin基因定位染色體于7p22，編碼一個分子量為55 kU的細胞骨架蛋白，Fasci蛋白單體有2個位點可與肌動蛋白結合，每2個單體可倒置形成二聚體，每個二聚體按1∶4比例與肌動蛋白結合，使肌動蛋白形成蛋白纖維間距離為8 nm的有序的平行束結構，該結構有利于加強肌動蛋白細胞骨架以利于抵抗由于細胞遷移時細胞突起運動引起的細胞膜延伸，從而對細胞移動起著重要作用〔14〕。因此，該基因高表達可能與腫瘤細胞的遷移有關。Puppa等〔15〕分析晚期結腸癌患者腫瘤組織中Fscn1基因編碼蛋白表達及其與患者臨床病理特征及預后關系發現，Fscn1基因高表達與腫瘤的浸潤和遠處轉移有關。

本研究提示Fscn1基因可能在NSCLC的發病中發揮重要作用，其高表達患者遠處轉移風險可能增加。因此，Fscn1基因在肺癌中表達水平明顯上調，且可能參與了肺癌的轉移過程。通過靶向一致Fscn1基因表達，有望成為NSCLC治療的新靶點。