STIL 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對基因組穩(wěn)定的影響

鐘錳 王曉嬌 王君 劉暢 朱彬 王鶴 李英夫 何偉明

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 通遼 028007；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病涉及一系列相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的改變，包括癌基因活化及抑癌基因的抑制。癌癥基因組圖譜計(jì)劃通過對206例神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床樣本大規(guī)模遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中眾多基因發(fā)生突變，主要涉及3條信號通路：酪氨酸激酶受體RTK/RAS/PI3K通路、p53通路及RB信號通路。其中，p53通路通過以p53為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控DNA損傷，募集損傷蛋白以維持基因組的完整性，P53的失活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔1〕。此外，隨著非編碼RNA領(lǐng)域的研究不斷深入，報(bào)道發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA、miRNAs也參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程〔2～5〕。然而，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究取得了一些進(jìn)展，但目前仍未全面揭示其發(fā)病的具體機(jī)制，臨床也無有效的腫瘤標(biāo)志物。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，尋找新型特異性腫瘤標(biāo)志物對于預(yù)測膠質(zhì)瘤的預(yù)后和復(fù)發(fā)至關(guān)重要。中心體是細(xì)胞中的主要細(xì)胞器之一，在進(jìn)化上高度保守。一個(gè)中心體包括2個(gè)中心粒及其周圍的中心粒周圍物質(zhì)，參與有絲分裂過程中紡錘體的組裝及細(xì)胞分裂。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中觀察到中心體異常。染色體不穩(wěn)定性和中心體擴(kuò)增異常是腫瘤細(xì)胞普遍具有的特征，通常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期階段，這為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的途徑〔6～8〕。作為一種癌基因，STIL(SCL/TAL1 interrupting locus)與生物體內(nèi)中心體的生成、復(fù)制及細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)。因此，本文旨在前期工作的基礎(chǔ)上，深入研究STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及意義，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診療提供可能的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44、U87、SWO-38及U251 與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系NHA。分別利用免疫組織化學(xué)(IHC)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)及蛋白質(zhì)(Western)印跡技術(shù)檢測STIL在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44、U87、SWO-38及U251 與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系NHA樣本中的表達(dá)情況。

1.2瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建 根據(jù)STIL在不同細(xì)胞系中表達(dá)，選取STIL高表達(dá)細(xì)胞系(U87細(xì)胞)及STIL低表達(dá)細(xì)胞系(U251細(xì)胞)，分別采用siRNA干擾技術(shù)及過表達(dá)技術(shù)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA及STIL過表達(dá)載體pcDNA3.1，建立STIL低表達(dá)/過表達(dá)細(xì)胞系。

1.3CCK8檢測干擾和過表達(dá)STIL后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 siRNA干擾技術(shù)敲低STIL的表達(dá)水平后，利用CCK8試驗(yàn)及克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測STIL低表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞增殖能力的影響；然后在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中瞬時(shí)過表達(dá)pcDNA3.1-STIL載體，CCK8實(shí)驗(yàn)及克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測STIL過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長情況的影響。

1.4流式細(xì)胞術(shù) 檢測STIL過表達(dá)/敲低細(xì)胞系對膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因組穩(wěn)定性及細(xì)胞凋亡的影響。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) SHG-44、U87、SWO-38及U251與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系NHA。在含有100 ml/L胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6Western印跡 使用RIPA裂解液裂解所收集細(xì)胞；提取細(xì)胞蛋白后采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度； 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；使用脫脂牛奶封閉 2 h；于4 ℃冰箱溫育一抗過夜；采用洗膜緩沖液(TBST)洗膜后溫育二抗2 h；使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光液曝光。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS25.0軟件和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行分析。NCAPD2表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 精確檢驗(yàn)分析法。在UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用單因素方差分析NCAPD2基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。在LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析與NCAPD2基因呈相關(guān)性的基因。

2 結(jié) 果

2.1STIL在不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá) STIL在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，在NHA細(xì)胞中為1.0，在U251細(xì)胞中為1.70～1.80，SHG-44中為2.11～2.21，SWD-38中為2.15～2.65。其中在U87細(xì)胞中表達(dá)最高為3.45～3.65。

2.2Western印跡技術(shù)檢測干擾后STIL的表達(dá) 在低表達(dá)細(xì)胞系U251細(xì)胞中構(gòu)建STIL過表達(dá)細(xì)胞系，在高表達(dá)U87細(xì)胞中構(gòu)建STIL低表達(dá)細(xì)胞系后，Western印跡檢測干擾后STIL的表達(dá)變化，結(jié)果顯示低表達(dá)/過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 Western印跡技術(shù)檢測干擾后STIL的表達(dá)

2.3CCK8檢測干擾和過表達(dá)STIL后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 兩組U87 細(xì)胞和U251細(xì)胞第1天增殖活力無顯著差異(P>0.05)；第2天后，STIL干擾組 U87 細(xì)胞增殖活力顯著低于對照組；STIL干擾組 U251 細(xì)胞增殖活力顯著高于對照組(P<0.05)。見表1、2。

表1 STIL干擾組低對U87細(xì)胞增殖活力的影響

表2 STIL過表達(dá)組低對U251細(xì)胞增殖活力的影響

2.4細(xì)胞周期檢測干擾和過表達(dá)STIL后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響 U87細(xì)胞中干擾STIL促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞阻滯；而U251細(xì)胞中過表達(dá)STIL可以降低G0/G1期細(xì)胞數(shù)。見表3、4。

表3 STIL干擾組對細(xì)胞周期G0/G1期的影響

表4 STIL過表達(dá)組對細(xì)胞周期G0/G1期的影響

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測干擾和過表達(dá)STIL后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響 STIL干擾組U87細(xì)胞凋亡率〔(17.01±0.81)%〕顯著高于對照組〔(5.88±0.67)%;t=14.851,P<0.000 1〕，說明U87細(xì)胞中干擾STIL促進(jìn)細(xì)胞凋亡；STIL過表達(dá)組U251細(xì)胞凋亡率〔(2.967±0.09)%〕顯著低于對照組〔(4.930±0.26)%;t=9.957,P<0.000 6〕，說明U251細(xì)胞中過表達(dá)STIL可以抑制細(xì)胞凋亡。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂過程中，STIL與其結(jié)合蛋白相互作用，確保中心體復(fù)制的保真性以減少染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生〔9〕。中心體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常能夠影響細(xì)胞分裂過程，而STIL在維持增殖細(xì)胞中心體完整性方面至關(guān)重要。研究表明在多種預(yù)后不良的腫瘤中STIL存在異常表達(dá)，包括肺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等〔10～12〕。更甚，STIL的表達(dá)水平與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)〔12〕。STIL發(fā)揮著原癌基因的作用，通過促進(jìn)紡錘體缺陷引發(fā)染色體不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔13〕。另外，大量文獻(xiàn)報(bào)道STIL參與調(diào)控音猬因子(SHH)信號通路也可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔14〕。在胰腺癌中過表達(dá)STIL可抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑(SUFU)介導(dǎo)的GLI1蛋白表達(dá)，而敲低STIL可逆轉(zhuǎn)上述表型。STIL過表達(dá)促進(jìn)GLI家族鋅指蛋白(GLI)1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，而GLI1的表達(dá)水平上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖、細(xì)胞死亡抗性、血管生成及基因組不穩(wěn)定性。因此，學(xué)者們推測STIL的過表達(dá)通過調(diào)控GLI1的功能進(jìn)而引發(fā)癌變〔15〕。作為癌基因，STIL為預(yù)后做出更準(zhǔn)確的評估及進(jìn)行分子靶向治療提供了可能。有報(bào)道指出通過抑制STIL能夠有效增強(qiáng)DNA損傷化療藥物在治療卵巢癌中的功效〔11〕。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干擾STIL后，p27的表達(dá)水平顯著上調(diào)。P27一般在G0/G1期升高，并在細(xì)胞有絲分裂后迅速降解，從而解除對細(xì)胞周期蛋白(cyclin)E/周期蛋白依賴性激酶(Cdk)2的抑制狀態(tài)，允許細(xì)胞周期進(jìn)展〔16〕。p27的減少廢除了對細(xì)胞周期從G1期到S期的過渡進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂疲瑫?dǎo)致不受控制的細(xì)胞生長和增殖，該機(jī)制與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生相關(guān)〔17～20〕。翻譯后修飾，特別是通過泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白水解，在正常細(xì)胞周期和病理?xiàng)l件下對p27蛋白豐度的調(diào)節(jié)有重要作用。本文結(jié)果表明，STIL過表達(dá)可通過影響細(xì)胞G0/G1期而改變了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的基因組穩(wěn)定性，STIL過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

綜上，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中STIL呈高表達(dá)，并參與細(xì)胞周期及 DNA修復(fù)等過程，有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療的新分子靶標(biāo)。