外泌體介導(dǎo)miR-199a-3p靶向ARPC2基因?qū)δI癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

樊松強(qiáng) 張紅森 湯堯

(1漯河市第二人民醫(yī)院泌尿外科，河南 漯河 462000；2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院泌尿外科；3西安航天總醫(yī)院泌尿外科)

外泌體是細(xì)胞分泌的可以在細(xì)胞間傳遞的一種囊泡，其內(nèi)包含miRNA、mRNA和蛋白等多種有生物活性的成分，是一類重要的細(xì)胞間通信分子，外泌體傳輸特異性miRNA可能在腫瘤的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，在腎癌等泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及診療上有很大的應(yīng)用前景〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-199a可抑制腎癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔3〕。miR-199a-3p能誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞周期G1期阻滯，抑制細(xì)胞侵襲，表明miR-199a-3p可作為腎癌診斷、預(yù)后判斷和治療的潛在靶點(diǎn)〔4〕。肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合亞基(ARPC)2是肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體(ARP2/3)家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)ARPC2在胃癌組織中高表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，與腫瘤大小、淋巴結(jié)浸潤(rùn)和腫瘤分期顯著相關(guān)〔5〕。ARPC2在上皮性卵巢癌中高表達(dá)，抑制ARPC2的表達(dá)抑制了細(xì)胞的遷移和增殖〔6〕。本實(shí)驗(yàn)探索外泌體介導(dǎo)miR-199a-3p對(duì)腎癌細(xì)胞惡性行為的影響，分析其機(jī)制是否與ARPC2有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 腎小管上皮細(xì)胞HK-2和腎癌細(xì)胞786-O購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；熒光定量試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購(gòu)自Sigma公司；外泌體分離純化試劑盒購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；miR-NC、miR-199a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p、si-NC、si-ARPC2、pcDNA-NC、pcDNA-ARPC2、野生型(WT)-ARPC2、突變型(MUT)-ARPC2質(zhì)粒購(gòu)自北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；抗體購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體提取 HK-2和786-O細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。待HK-2和786-O細(xì)胞密度融合至70%左右時(shí)將培養(yǎng)液換成去除外泌體的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心20 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，上清液用0.22 μm的濾器過(guò)濾，加入外泌體分離純化試劑混勻后4℃過(guò)夜，1 500 r/min離心30 min，去上清，沉淀即為富集的外泌體，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸備用。取重懸的外泌體滴在直徑為2 mm的銅網(wǎng)上，用濾紙將多余液體從邊緣吸去，將20 μl的2%磷鎢酸鹽滴在銅網(wǎng)上，室溫下復(fù)染10 min，蒸餾水清洗2次后用濾紙吸除多余液體，將銅網(wǎng)于白熾燈下烤干，透射電鏡下于80 kV下觀察外泌體形態(tài)，并拍攝電鏡照片。

1.2.2過(guò)表達(dá)miR-199a-3p細(xì)胞外泌體中miR-199a-3p的表達(dá)及外泌體表面標(biāo)志物CD63、CD81表達(dá)水平 將miR-NC、miR-199a-3p轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞后用去除外泌體的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，提取外泌體。實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)水平：提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。Western印跡檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物CD63、CD81表達(dá)水平：取80 μg相應(yīng)外泌體，加入蛋白裂解液，吹打混勻后冰上孵育30 min，于4℃條件下1 000 r/min離心30 min，取上清，定量變性。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、濕法轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉膜，然后加入1∶1 000稀釋一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，用1∶2 000稀釋二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌，用電化學(xué)(ECL)發(fā)光液顯影。ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像后，Quantity One分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的相對(duì)吸光度。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將miR-NC、miR-199a-3p轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中后加入外泌體進(jìn)行培養(yǎng)，記為EXO-miR-NC組、EXO-miR-199a-3p組；將miR-199a-3p分別與pcDNA-NC、pcDNA-ARPC2共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中后加入外泌體進(jìn)行培養(yǎng)，記為EXO-miR-199a-3p+pcDNA-NC組、EXO-miR-199a-3p+pcDNA-ARPC2組。將miR-NC、anti-miR-NC、miR-199a-3p、anti-miR-199a-3p、si-ARPC2、si-NC分別轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中，分別記為miR-NC組、anti-miR-NC組、miR-199a-3p組、anti-miR-199a-3p組、si-ARPC2組、si-NC組。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)786-O細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)水平 各組培養(yǎng)48 h后提取總RNA，參照1.2.2步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。

1.2.5Western印跡檢測(cè)786-O細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2、MMP-9、ARPC2蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，按照1.2.2步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.6MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h；棄培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后振蕩溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm各孔吸光度(OD)值。每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液。取200 μl接種于涂覆基質(zhì)膠Transwell上室(侵襲檢測(cè))或未涂覆基質(zhì)膠的Transwell上室(遷移檢測(cè))。下室加入600 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去上室培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.8熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-199a-3p對(duì)ARPC2的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-199a-3p結(jié)合位點(diǎn)ARPC2-3′UTR野生型及突變型報(bào)告基因載體WT-ARPC2、MUT-ARPC2，在786-O細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p+WT-ARPC2、miR-199a-3p+MUT-ARPC2、miR-NC+WT-ARPC2、miR-NC+MUT-ARPC2。48 h后測(cè)定熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-199a-3p在腎癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體中表達(dá)情況 提取腎小管上皮細(xì)胞HK-2和腎癌細(xì)胞786-O培養(yǎng)基中的外泌體，透射電子顯微鏡下觀察兩者形態(tài)均為典型外泌體結(jié)構(gòu)，有完整雙層脂膜包被的杯口狀的囊泡樣結(jié)構(gòu)(圖1)。與腎小管上皮細(xì)胞HK-2 miR-199a-3p表達(dá)水平(1.00±0.12)相比，腎癌細(xì)胞786-O外泌體(0.35±0.04)顯著降低(P<0.05)。表明腎癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體中miR-199a-3p低表達(dá)。

圖1 電鏡觀察HK-2、786-O細(xì)胞系外泌體的形態(tài)(×400)

2.2外泌體中miR-199a-3p表達(dá)情況 miR-199a-3p組外泌體中miR-199a-3p表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(P<0.001)。見圖2、表1。

圖2 Western印跡檢測(cè)CD63、CD81蛋白表達(dá)

表1 外泌體中miR-199a-3p表達(dá)情況

2.3外泌體介導(dǎo)miR-199a-3p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O增殖、遷移和侵襲的影響 EXO-miR-199a-3p組腎癌細(xì)胞786-O中miR-199a-3p表達(dá)水平顯著高于EXO-miR-NC組，CyclinD1、MMP-2和MMP-9、ARPC2表達(dá)水平顯著低于EXO-miR-NC組，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著低于EXO-miR-NC組(均P<0.001)。見圖3，表2。表明外泌體介導(dǎo)miR-199a-3p抑制腎癌細(xì)胞786-O增殖、遷移和侵襲。

A：Transwell檢測(cè)786-O的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)；B：Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

2.4敲減ARPC2對(duì)腎癌細(xì)胞786-O增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組相比，si-ARPC2組腎癌細(xì)胞786-O中CyclinD1、MMP-2、MMP-9和ARPC2表達(dá)水平顯著低于si-NC組，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著低于si-NC組(P<0.05)。見圖4、表3。表明敲減ARPC2抑制腎癌細(xì)胞786-O增殖、遷移和侵襲。

A：Transwell檢測(cè)786-O的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)；B：Western印跡檢測(cè)ARPC2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

2.5miR-199a-3p靶向ARPC2 StarBase預(yù)測(cè)ARPC2與miR-199a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。相較于miR-NC組，miR-199a-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ARPC2的細(xì)胞786-O的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)；而轉(zhuǎn)染MUT-ARPC2表達(dá)載體的細(xì)胞786-O的熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)，見表4。miR-199a-3p組ARPC2表達(dá)水平(0.43±0.05)顯著低于miR-NC組(0.98±0.10，P<0.05)；anti-miR-199a-3p組ARPC2表達(dá)水平(1.28±0.13)顯著高于anti-miR-NC組(0.96±0.11，P<0.05)，見圖6，表明miR-199a-3p可靶向調(diào)控ARPC2的表達(dá)。

圖5 StarBase對(duì)miR-199a-3p和ARPC2結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)

1～4：miR-NC組，miR-199a-3p組，anti-miR-NC組,anti-miR-199a-3p組圖6 Western印跡檢測(cè)ARPC2表達(dá)量

2.6高表達(dá)ARPC2可以部分逆轉(zhuǎn)外泌體介導(dǎo)的miR-199a-3p對(duì)786-O增殖、遷移和侵襲的影響EXO-miR-199a-3p+pcDNA-ARPC2組786-O細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9和ARPC2表達(dá)水平顯著高于EXO-miR-199a-3p+pcDNA-NC組，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著高于EXO-miR-199a-3p+pcDNA-NC組(P<0.05)。見圖7、表5、圖8。表明高表達(dá)ARPC2可以部分逆轉(zhuǎn)外泌體介導(dǎo)的miR-199a-3p對(duì)786-O增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖7 Transwell檢測(cè)786-O的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

1，2：EXO-miR-199a-3p+pcDNA-NC組,EXO-miR-199a-3p+pcDNA-ARPC2組圖8 Western印跡檢測(cè)ARPC2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

3 討 論

腎癌發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重危害人類身體健康，腫瘤晚期多數(shù)伴有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良，尋找其早期標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期治療具有重要意義〔7〕。外泌體是細(xì)胞分泌的小囊泡，可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的信號(hào)通路而發(fā)揮生物學(xué)作用，在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中不僅促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及血管生長(zhǎng)，可作為泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的生物標(biāo)志物，還可作為遞送RNA、化療藥物以及制備腫瘤疫苗的載體用于惡性腫瘤的治療〔8〕。研究報(bào)道m(xù)iR-210在腎癌患者血清外泌體中明顯高表達(dá)，血清外泌體miR-210水平可作為腎透明細(xì)胞癌早期診斷的標(biāo)志物〔9〕。miR-199a-3p在腎透明細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，miR-199a-3p過(guò)表達(dá)影響腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡〔10〕。p53誘導(dǎo)miR-199a-3p抑制順鉑誘導(dǎo)急性腎臟損傷〔11〕。以上結(jié)果表明miR-199a-3p對(duì)腎癌具有抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可通過(guò)將miR-199a-3p轉(zhuǎn)運(yùn)至腎細(xì)胞，下調(diào)Sema3A表達(dá)并從而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑來(lái)保護(hù)腎缺血/再灌注損傷〔12〕。本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可以提高癌細(xì)胞外泌體中miR-199a-3p的水平。CyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，其低表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期發(fā)揮抗增殖功能〔13〕；MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員，其低表達(dá)減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制遷移和侵襲〔14〕。說(shuō)明外泌體介導(dǎo)的miR-199a-3p可抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

ARPC2是ARP2/3的一員，而ARP2/3復(fù)合物與人膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)，ARPC2可能也與腫瘤的遷移、侵襲相關(guān)〔15〕。苯丙哌林是ARPC2抑制劑，可抑制癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移，說(shuō)明抑制ARPC2表達(dá)可抑制癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移〔16〕。ARPC2在乳腺癌癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移；且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的總體存活高度相關(guān)〔17〕。沉默ARPC2抑制了過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移〔18〕。本研究結(jié)果說(shuō)明敲減ARPC2可抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；外泌體介導(dǎo)的miR-199a-3p可能通過(guò)調(diào)控ARPC2影響腎癌細(xì)胞惡性表型。