循環腫瘤DNA在肝細胞癌中的研究現狀及展望

侯志遠，劉 源，楊超然，趙繼森，程樹杰

河北大學附屬醫院 肝膽外科，河北 保定 071000

原發性肝癌被認為是全球第六大最常診斷的癌癥，也是全球第三大癌癥死亡原因，肝癌在全球發病率中排名第五，其中肝細胞癌(HCC)占75%～85%[1]。中國是肝癌的發病大國之一，據統計，全世界肝癌患者中55%來自中國[2]。肝癌的主要危險因素是慢性HBV或HCV感染、黃曲霉毒素B1暴露、飲酒和代謝綜合征[3]。目前HCC的全球負擔仍在增加，可能很快超過每年100萬例的發病率[4]。盡管臨床治療(如切除)取得了進步，但由于復發和轉移，晚期肝癌患者的預后并不理想，因此，術前早期診斷、術后恰當的輔助治療成為延長患者生存期的重要方法，但由于缺乏可靠的診斷手段和有效的治療方法，肝癌的死亡率在我國仍排在第2位[5]，故需要迫切尋找更敏感、更具特異性的生物標志物和治療靶點。目前，肝癌患者經過治療后，通常使用影像學檢查作為常規的臨床監測方法，雖然包括CT、MRI或超聲造影在內的成像技術已將靈敏度從66%提高到82%，特異度提高到90%以上，但僅僅是用于檢測直徑至少為1 cm的結節[6]，而對直徑<1 cm的極早期或不典型肝癌，使用液體活檢技術則更有助于診斷及制訂治療方案。

液體活檢的新診斷概念在過去幾年中得到了極大的關注[7]。液體活檢技術收集人體非固體生物組織的樣本(如血液)用于不同的分析，其他的體液也可用于特殊的液體活檢，如用于中樞神經系統腫瘤的腦脊液、用于頭頸部腫瘤的唾液、用于胸腔及轉移性腫瘤的胸水、用于腹部及轉移性腫瘤的腹水、用于胃腸道腫瘤的糞便和用于尿道癌的尿液[8]。液體活檢由循環腫瘤細胞、細胞游離核酸[如循環腫瘤DNA(ctDNA)]、外泌體或腫瘤誘導的血小板等不同的生物基質組成。

游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)是Mandel和Metais在1948年首次報道的在血液非細胞成分中發現的片段化DNA[9]。cfDNA通常為150～200個堿基對大小的雙鏈DNA片段，其主要通過細胞凋亡或壞死釋放到血流中。來自正常細胞的cfDNA在血漿中含量較低(平均為10～15 ng/mL)[10]，并且在一些生理或者病理情況下(如運動、炎癥、糖尿病、敗血癥、心肌梗塞及孕婦)，cfDNA的水平會增加[11]。據觀察，癌癥患者中的cfDNA總體水平高于未患癌癥的人[10]。ctDNA是特異性來源于原發性或轉移性腫瘤的cfDNA的一部分，盡管ctDNA在cfDNA中具有<0.1%～>90%的波動比例[8]，但因其具有短半衰期、高敏感性、微創性、攜帶腫瘤的遺傳信息等特點，可對其進行定量或定性分析，從而確定其在腫瘤的早期診斷、治療和進展監測方面的重要臨床價值[12]。事實上，ctDNA的潛在價值在包括肝癌在內的各種癌癥中得到了廣泛的研究[13]。

1 ctDNA在HCC中的應用

目前，美國食品藥品監督管理局(FDA)已批準cfDNA應用于非小細胞肺癌的治療[8,14]，通過檢測血漿中表皮生長因子受體(EGFR)的突變情況來指導靶向藥物的應用，還可用于檢測EGFR靶向酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療后癌癥進展患者的T790M EGFR突變，這種突變會導致治療耐藥，從而指導更換靶向藥物為第三代EGFR抑制劑(如奧希替尼)。同時，FDA也批準了cfDNA在結直腸癌中的應用[14]，通過檢測血漿中SEPT9啟動子的甲基化狀態來指導藥物對結直腸癌的應用，且已證實cfDNA高甲基化狀態與結直腸癌的發生有關。

隨著監管機構批準了多種新藥，晚期HCC的臨床管理在過去幾年中發生了顯著變化[15]。一線和二線的治療分配不是基于腫瘤特征，因為除了甲胎蛋白和雷莫蘆單抗以外，沒有生物標志物可以預測對任何特定治療的反應[16]。von Felden等[17]為了能夠分析基因的突變情況并確定對全身治療反應的預測性生物標志物，研究了121例晚期HCC患者的突變情況，結果發現具有PI3K/MTOR通路中DNA突變的患者在接受索拉非尼治療后的無進展生存期明顯短于沒有突變的患者，說明PI3K/MTOR通路是索拉非尼耐藥的主要驅動因素。盡管研究結果還需要大量的實驗進行驗證，但也證明了ctDNA分析的臨床實用性及其對未來HCC生物標志物開發的重要性。

如今，移植腫瘤學在治療肝膽惡性腫瘤方面具有廣闊的應用前景，但由于術后復發和移植后排斥，使得移植腫瘤學的發展受到阻礙。cfDNA已經成為器官移植患者管理的重要工具，cfDNA技術的進步為進行微小殘留病灶(MRD)的移植前評估、移植排斥和癌癥復發的移植后評估提供了選擇[18]。Ng等[19]連續2年進行試驗，結果表明GcfDNA片段的大小譜是評估肝移植后移植物損傷和排斥反應的潛在生物標志物。

1.1 ctDNA在HCC診斷中的應用 大多數HCC在早期是無癥狀的，而往往都是在后期被發現。目前，AFP是使用最廣泛的HCC腫瘤標志物，但其缺乏敏感度(39%～65%)和特異度(76%～94%)[3]，在早期肝癌中無法被檢測到，甚至還會出現假陰性結果[20]。Chen等[21]分析了10項研究，他們評估了ctDNA與AFP聯合檢測的方法，發現ctDNA和AFP的聯合檢測比單獨檢測AFP能更準確地識別肝癌患者，并且相比于影像學檢測，ctDNA檢測能更早的識別出疾病復發或進展的患者。

盡管HCC中沒有明確的致癌基因[1]，但研究[22]已經驗證了檢測ctDNA中與HCC相關的體細胞突變以篩查早期患者的可行性。Wang等[13]檢測到ctDNA中存在非常普遍的基因改變，如TP53、CTNNB1、AXIN1和TERT啟動子，并且這項檢測在包含331例患者的驗證隊列中表現出100%的敏感度和94%的特異度。研究[13]表明，基因啟動子的高甲基化已被證明是HCC發生的早期事件。DNA甲基化可導致染色質結構、DNA構象、DNA穩定性以及DNA與蛋白質的相互作用發生變化，從而控制基因表達。Mohamed等[23]的實驗結果表明，血清RASSF1A的甲基化水平可能有助于早期診斷HCC，尤其是在HCV感染的高危患者中。另外，即使HCC患者在相似的巴塞羅那臨床肝癌分期系統(BCLC)階段，不同的個體可能具有不同的分子特征，因此對靶向治療的反應不同[24]。故而，在診斷時對自身腫瘤分子特征進行分類識別對于了解腫瘤的生物學背景、指導患者分層、提高治療效果、預測預后至關重要[22]。

1.2 ctDNA判斷HCC患者的預后 早期研究[25]表明，血漿中cfDNA水平與腫瘤負荷顯著相關，因其具有高度特異性和短的半衰期，使得cfDNA具有預后價值的獨特優勢。有證據[26]表明，cfDNA突變可能與血管侵襲密切相關，且cfDNA突變患者的無復發生存期更短。García-Fernández等[27]發現，cfDNA中突變的P53基因可能被用作HCC患者肝移植后腫瘤復發的生物標志物。此外，因其較短的半衰期，cfDNA對治療后腫瘤負荷的變化可以做出快速反應，因此可以通過檢測腫瘤特異性分子的改變情況來改善預后。還有研究[28]表明，HCC患者手術后cfDNA水平顯著下降，表明動態監測cfDNA水平的變化可以為術后殘留病變和早期復發提供實時信息。

最近，對155例接受手術切除的HCC患者的一項研究[29]表明，cfDNA中胰島素樣生長因子結合蛋白7的啟動子甲基化與較差的總生存期和早期腫瘤復發存在顯著聯系。也有報道稱，ctDNA中的異常甲基化可識別AFP陰性的HCC患者[30]，并且異常甲基化與轉移或復發風險增加[31]、更大的腫瘤[32]和更差的預后[30,32]相關。總體而言，ctDNA的濃度、突變和甲基化模式等變化可以為檢測殘留病變、識別早期復發和預測HCC預后提供參考。

1.3 ctDNA指導個體化用藥 cfDNA應用于個體化治療的腫瘤基因譜鑒定，這已成為癌癥醫學的基本實踐[33]。近年來，免疫療法已經成為HCC患者治療所選擇的最有希望的方法之一[34]。TKI一直是局部晚期HCC患者的標準全身治療選擇，一線藥物如索拉非尼和侖伐替尼顯示出較好的療效，二線藥物如瑞戈非尼、卡博替尼和雷莫蘆單抗為晚期HCC的序貫全身治療提供了更多機會。然而，只有不到40%的HCC患者才有資格接受免疫治療[35]，咎其原因可能是復雜和異質的突變環境。使用ctDNA對HCC中的突變進行量化已被證明是對免疫治療和TKI反應的非常好的預測指標。因此，迫切需要評估和開發ctDNA的用途，以檢查其是否可以成為評估免疫療法或TKI反應的有效工具。研究[36]表明，TP53基因組的改變與VEGF-A表達增加相關，此類腫瘤可能成為貝伐珠單抗等抗血管生成藥物的靶點。同時，一項針對于TP53突變的非小細胞肺癌患者的回顧性研究[37]表明，采用含貝伐珠單抗治療的無進展生存期更長于不含貝伐珠單抗治療的患者。另一項前瞻性研究[17]表明，PI3K/MTOR通路突變的患者在使用TKI后的無進展生存期明顯短于沒有這些突變的患者，但不是在免疫檢查點抑制之后，說明ctDNA可作為對全身治療原發性耐藥的預測因子。

1.4 通過ctDNA監測對治療的反應 ctDNA檢測除了指導分子靶向治療以外，還可能有助于監測治療反應，因為血漿中的突變狀態已被證明可以反映患者的腫瘤負荷并與患者的臨床狀態有關[38]。到目前為止，尚未檢測到相同的基因組譜，這表明分析患者的突變基因組景觀可以實現有針對的特異性治療。例如，Ikeda等[39]評估了14例患者，結果表明具有PTEN失活和MET激活突變的晚期HCC患者可以從西羅莫司和卡博替尼的治療中受益，具有CDKN2A失活和CTNNB1激活突變的患者在接受帕博西尼和塞來昔布聯合治療后，AFP水平降低。其次，ctDNA還可以作為評估瑞美替尼單藥治療和瑞美替尼與索拉非尼聯合治療在具有突變RAS等位基因的晚期HCC患者中的治療效率的合格工具[40]。此外，Galle等[41]研究證明，上皮-間質轉化(EMT)驅動的DNA甲基化是晚期HCC患者對索拉非尼耐藥性的基礎。因此，通過監測EMT過程中ctDNA的甲基化變化，可以預測腫瘤反應及耐藥機制。

以免疫檢查點阻斷(ICB)為代表的免疫療法已經改變了癌癥治療的臨床實踐。目前，對于血清AFP水平≥400 ng/mL的晚期HCC患者，推薦雷莫蘆單抗作為索拉非尼之后的二線藥物[16]。盡管ICB全身治療取得了初步成功，但需要使用分子檢測來確定適合免疫治療的患者。ctDNA可以區分真正的腫瘤進展和由ICB治療造成的炎癥引起的假進展[15]，并且ctDNA中某些特定基因的改變可能與免疫相關不良事件有關[42]。

肝切除、肝移植和局部治療(如消融治療、動脈化療栓塞、內外放療和肝動脈灌注化療)已被廣泛應用于HCC的治療[28，43]。盡管如此，5年內HCC患者的術后復發率仍保持在>60%的高水平[44]，相當多的術后患者可能有隱匿性微轉移或MRD，而沒有臨床或影像學跡象。然而，ctDNA可以作為檢測MRD的生物標志物。值得說明的是，MRD是指癌癥在治療后體內持續存在的低于常規檢測標準的殘留在體內的少量癌細胞。這部分癌細胞多屬于對治療無反應或耐藥的癌細胞，一般不會引起任何癥狀或體征，且不能被傳統影像學(包括PET/CT)或實驗室檢查方法發現。并且研究[45]表明，MRD的存在與復發風險增加和較短的生存期有關。如今，MRD檢測技術已被應用于部分血液系統疾病中(如急性髓性白血病)[46]。Cai等[26]的一項研究結果顯示，術后ctDNA陽性患者被認為是早期復發或轉移的高危風險因素，說明ctDNA可以作為監測HCC中MRD的可靠生物標志物。其結果還顯示，ctDNA與蛋白質生物標志物脫-γ-羧基凝血酶原的結合提高HCC患者MRD評估的敏感度，這將有利于更好的指導術后治療的臨床決策。另一項研究[47]也得出了類似的結論，研究者鑒定了4種熱點突變(TP53-rs28934572、TRET-rs1242535815、CTNNB1-rs121913412 和 CTNNB1-rs121913401)，結果表明ctDNA中特定的突變可定義為HCC患者術后復發的獨立危險因素。此外，ctDNA可以實時監測不同突變體的縱向變化和治療反應。例如，Cai等[25]報道了1例患有體細胞突變(HCKp.V174M)的患者，這種改變在第1次TACE治療后被發現，然后在第2次肝臟手術后變得無法檢測到，并在第2次復發時急劇增加。總之，與傳統的影像學檢查和蛋白質生物標志物不同，跟蹤ctDNA的體細胞突變頻率能夠實時監測腫瘤負荷和評估預后結果。

2 挑戰與展望

盡管ctDNA作為用于無癥狀個體和殘留疾病的癌癥檢測的新型液體活檢標志物已獲得相當大的關注，但要實施于臨床工作中仍存在許多挑戰。由于ctDNA從癌細胞中釋放出來，其攜帶腫瘤特異性遺傳信息或表觀遺傳變化，這些信息在正常cfDNA中是找不到的，因此準確檢測和區分有效的ctDNA與正常cfDNA非常重要。同時血漿中的ctDNA主要來源于腫瘤細胞的破裂和釋放，血漿ctDNA的濃度會受到不同生理和病理條件的影響，這些影響會增加ctDNA的降解或白細胞裂解產生的細胞基因組DNA的污染[48]。所以，如何保證ctDNA是癌癥特異性來源并不含有其他雜質的，這就成為一個不容忽視的新問題[37]。還有研究[49]已經證明，造血細胞具有非惡性突變的克隆造血。這就模糊了cfDNA是來自外周血細胞的破裂還是造血細胞的克隆性造血，造成基于特定cfDNA基因分型指導癌癥治療的準確性降低。事實上，人們一致認為通過使用細胞穩定管并避免重復凍融循環進行特殊處理可以提高ctDNA的產量和純度，但是不同的ctDNA純化方法和各種修改方案都可能會對結果造成影響。其次，與患者相關的因素(如醫療、吸煙、運動、與年齡相關的克隆性造血、炎癥或心肺疾病等)，也有助于ctDNA的釋放[11]。此外，臨床醫生迫切需要一種具有高敏感度和特異度的通用工具來保證研究結果的準確性。

盡管ctDNA的突變及其甲基化模式作為MRD的檢測已成功應用于晚期常見癌癥，但15%的轉移性癌癥患者可能沒有足夠的ctDNA水平來進行血漿突變分析[50]。另外，HCC患者缺乏有效的藥物治療和普遍可行的突變，導致基于HCC相關基因突變的血漿中基于ctDNA的MRD檢測的醫學應用很少。在過去十年中，已經開發了許多用于ctDNA基因分型的檢測技術(如ddPCR、NGS、MFC等)。然而，每種技術的測試特征各不相同，并且適用于不同檢測下限的不同患者群體。因此，若要直接比較各種技術的高診斷特異度與適度敏感度，需要嚴格的交叉分析比較。ctDNA檢測對癌癥的低診斷敏感度可能是導致組織和ctDNA基因分型結果不一致的主要原因[51]。

根據系統生物學的觀點，基因組代表的是一種潛能，其經轉錄和翻譯之后所形成的基因產物——蛋白質是機體生物學行為的最終“執行者”，與癌癥的發生、發展和治療直接相關。而且，蛋白質的表達并不完全依從于基因組：一方面基因組水平檢測到的突變在翻譯階段可能會存在沉默表達，最終并沒有執行實際生物學功能；另一方面許多癌癥的發生可能起源于蛋白質整個翻譯過程的調控階段，而僅基于DNA層面的突變檢測難以確定其與腫瘤發生的相關性。此外，遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質的過程中存在級聯放大現象，一個DNA分子由多個堿基對組成，因堿基對突變的多樣性，故產生的蛋白質同樣具有多種性，此處包含了轉錄、非編碼調控、翻譯效率、蛋白修飾等的影響，也包含與該蛋白相互作用或者同一信號通路的相關分子的改變。另外值得注意的是，在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤的周圍環境也會隨之發生改變，該改變甚至會早于腫瘤發生，機體的免疫監測及反應在不同患者之間甚至在不同癌癥之間可能不盡相同。由于該步驟不涉及核酸序列水平變化，常規的DNA檢測無法企及。通過蛋白(或蛋白多組學)進行腫瘤特征分子發現，可以進一步過濾假陽性的可能。

在精準個體化治療的時代，ctDNA檢測技術改變了腫瘤的診斷方式和治療方案，因其可應用于腫瘤的早期診斷、預后判斷、療效檢測及復發預警等多個方面，從而為臨床工作帶來了新的決策思路。但因其獨特的生物學特點、檢測方法和技術的限制，應用于臨床實踐仍有較大難度。考慮市場應用前景、產品研發進程及蛋白質在生命活動中的關鍵位置，基于蛋白的檢測技術有必要嘗試，且值得期待。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：侯志遠負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉源、楊超然參與收集數據，修改論文；趙繼森、程樹杰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。