肝細胞極性調控

毛元鵬，魏紅山,2

1 北京大學地壇醫院教學醫院 消化科，北京 100015；2 首都醫科大學附屬北京地壇醫院 消化科，北京 100015

細胞極性是多數細胞維持正常生理生化功能的必需屬性。無論是上皮細胞，還是不對稱分裂細胞，均高度依賴細胞極性以維持其正常功能[1]。1926年，Bunting等[2]發現機械張力決定著正在發育的分裂期成纖維細胞的極性和空間位置。從最簡單的無脊椎動物，到脊椎動物上皮細胞的結構分布，均存在不同形態的細胞極性。許多極性決定因子具有腫瘤抑制或促癌作用，并且在各種不同的腫瘤細胞中表達異常[3]。肝細胞具有特殊的細胞極性，并且其極性的穩定性與多種肝病相關，其中的極性調控分子機制仍有待闡明。

1 對肝細胞極性的認識過程

肝實質細胞是肝臟的主要功能細胞，是高度特化的極性上皮細胞。1975年，Evans等[4]報道了對大鼠肝細胞表面膜功能極性的研究，這是較早有關肝細胞極性的相關研究。隨后，研究人員在新鮮分離的大鼠肝細胞中發現，細胞極性喪失的同時，細胞間連接結構也無法檢測到，提示細胞間連接與肝細胞極性之間有著重要聯系。1993年，研究人員進一步發現Disse間隙中的細胞外基質(ECM)控制著肝細胞極性的發展。得益于過去數十年的深入研究，目前對肝細胞極性的認識已有了重大進展，眾多相關蛋白分子及結構成分被逐漸揭示。然而，更為全面的肝細胞極性調控分子機制研究仍然有待進一步完善。

2 影響肝細胞極性的結構特征

肝細胞極性分為結構極性和功能極性。每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面，肝細胞極性機制便體現在細胞形態和功能上。肝細胞通過竇狀隙面與血液循環進行物質交換，從膽小管面分泌膽汁，而肝細胞面則參與細胞間接觸。為了介導這些功能，肝細胞形成不同的極化腔域，并通過緊密連接(tight junction，TJ)隔開[5]。一旦肝細胞極性受到破壞，肝細胞的物質交換、膽汁分泌等重要生理功能將會發生障礙，導致多種肝臟疾病的發生。ECM的穩定性以及細胞間連接是決定肝細胞極性的關鍵，多蛋白及其復合體參與了肝細胞極性的維持。

2.1 細胞間連接 上皮細胞主要有3種細胞間連接方式：TJ、黏附連接(adherens junction，AJ)和橋粒。在單細胞培養實驗中發現，單細胞呈現出無極性狀態，提示細胞極性的建立和維持依賴細胞間連接的存在。

TJ是位于細胞-細胞接觸最頂端區域的上皮細胞間連接，由跨膜蛋白和將連接復合物與細胞骨架連接的胞質蛋白組成，包括密封蛋白-1(claudin-1，CLDN1)，連接黏附分子，閉鎖連接蛋白1、2、3等。TJ的組裝通過調節膜蛋白的極化定位，維持細胞極性的穩定，并產生電化學濃度梯度，從而維持上皮細胞的物質運輸功能[6]。此外，TJ還充當極性信號蛋白的支架，包括Par3/Par6/非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)復合物和Crumbs/PALS1/PATJ復合物，從而在細胞極性中發揮作用。最近研究[7]發現，TJ蛋白Par3通過與小GTPase Cdc42合作將aPKC靶向至細胞-細胞接觸中心附近以組織肝細胞極化。

AJ由上皮細胞鈣黏蛋白、α-catenin和β-catenin等組成，對上皮細胞極性的產生和維持起著重要作用。鈣黏蛋白是AJ的關鍵成分，其下調可引起AJ的破壞，進而導致細胞極性喪失，在多種腫瘤中發揮促進腫瘤侵襲的作用[8]。

細胞間連接將上皮細胞連接在一起形成結構和功能的連續體，連接的完整性決定了上皮細胞正常功能的行使，而連接的缺陷將導致組織的廣泛異常，破壞體內平衡，繼而引發各類疾病。

2.2 細胞外基質(ECM) ECM是一種復雜的大分子網絡結構，負責維持組織的結構完整性并調節細胞和組織功能[9]。肝細胞中極性和功能的成熟依賴于細胞-ECM之間的相互作用。在體外實驗中，肝細胞在塑料上培養不表現出極性，而在ECM培養中有極性表達。而且，ECM-細胞-ECM形成的“三明治”結構對細胞極性的產生和維持起著關鍵作用。顯然，作為ECM骨架結構的膠原蛋白空間是構成ECM的核心。前期筆者團隊[10-11]對肝星狀細胞的功能調控研究即發現，抑制O-糖基化修飾可加重肝損傷，并對膠原蛋白表達具有直接的抑制作用。近期，筆者團隊[12-14]研究發現，抑制膠原蛋白的Glcα1和2Galβ1-糖基化修飾可導致肝細胞損傷及膠原分泌障礙及脂質代謝異常；進一步觀察發現小鼠胚胎致死(E11.5)，伴有肝臟等中胚層發育異常。體外膠原蛋白夾層培養實驗[15]表明，ECM蛋白與某些生長因子在特定區域的定位是肝細胞極性表型發育所必需。

2.3 極性蛋白復合體 上皮細胞頂-底極性復合體主要包括Scribble復合體、Crumbs復合體以及Par復合體，這些極性蛋白復合體在細胞極性的建立和調控上發揮著重要作用。

Scribble復合體位于上皮細胞基底膜，由Scrib、Lgl和Dlg 3種蛋白組成，與細胞極性的建立有關。正常肝臟組織中，Scrib蛋白主要表達于細胞膜上；而在肝臟腫瘤中，Scrib蛋白呈高表達狀態，并主要表達于細胞質和細胞核[16]。研究[17]顯示，肝細胞癌(HCC)患者肝臟Scrib蛋白過表達與患者的不良預后相關，Scrib蛋白過表達并富集于胞質，引起細胞極性異常，促進了HCC發展和轉移。

Crumbs復合體位于頂端結構域，包括跨膜蛋白Crumbs和胞內信號接頭蛋白PALS1、PATJ。Crumbs復合物與上皮極性和細胞連接形成相關，在HIPPO通路中是重要的上游調節劑。Crumbs蛋白對細胞極性的影響與一些氨基酸位點有關，第7位精氨酸對Crumbs招募膜突蛋白和β-spectrin有作用從而影響AJ形成[18]，第6位和第9位氨基酸影響頂部決定因子之間的正反饋以及頂-基底之間決定因子的相互拮抗[19]，從而影響細胞頂-底極性的建立。

Par復合物，包括Par3-Par6-aPKC復合物，在進化上十分保守，與TJ的建立有關。Par蛋白家族包括Par1～6，各自具有不同結構域及功能。Par3作為Par3/Par6/aPKC復合體的中心組織者，對細胞極性的建立和維持至關重要。Par3的缺失將導致PAR復合物的分離和上皮極性的喪失。轉錄因子SNAIL家族蛋白——SNAI1 是促進上皮特征(包括極性和連接)喪失的關鍵因素。SNAI1蛋白不穩定，aPKC介導的SNAI1磷酸化促進SNAI1蛋白降解，使內源性SNAI1蛋白失穩，從而維持上皮特征，防止上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發生[20]。因此，Par復合物缺失介導的極性破壞可能通過SNAI1促進體內腫瘤的侵襲和轉移[21]。

目前，已經在多種人類癌癥中發現極性蛋白復合物的異常，提示極性蛋白的改變不僅破壞細胞極性，并對癌癥的發生發展可能有直接的影響。

3 研究肝細胞極性的細胞學模型

隨著各種生物技術的發展，肝細胞的培養技術日漸成熟。然而，傳統的3D培養無法有效保持肝細胞極性。Jia等[22]采用微流控芯片三維培養技術與天然海藻酸鹽水凝膠相結合，通過借鑒肝細胞在肝臟的極性肝板排列，及其與非實質細胞、ECM相互作用的仿生學原理，構建模仿肝板的3D肝組織，從而有效保持肝細胞極性。在該培養技術中，肝細胞的功能、極性蛋白的表達均隨著培養時間的增加而得到增強，表明該技術可以提供更好的體外3D培養平臺，可用于藥物開發、肝細胞極性研究等。

在既往研究中，關于肝細胞極性的組成和機制均在極化細胞(HepG2、WIF-B、和犬腎細胞等)中確定。近些年來，不斷有新的極性功能實驗在多能干細胞中進行，并且取得了重大進展。多能干細胞是一類具有自我更新、自我復制能力的多潛能細胞，具有分化為多種細胞組織的潛能。誘導多能干細胞衍生的肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cell，HLC)可以提供一個新的選擇來滿足極化肝細胞培養模型的需求。HLC通常在2D培養條件下在培養皿中分化，這一過程效率低下且產生的HLC不成熟，缺乏關鍵的體內特征，包括細胞極性。最近有研究[23]報道一種基于干細胞分化，使用TransWell濾過器生成柱狀極化HLC的方案，并證實極化HLC定向分泌物質。這種新穎的干細胞分化方案提供了一個強大的細胞培養系統來研究適當的肝細胞功能，這不僅有利于更好地了解正常的肝臟生理，而且還能進一步了解極性相關肝病的發病機制。值得注意的是，在HLC培養過程中，細胞間相互作用是誘導細胞極性和功能成熟的重要因素[24]。

4 肝細胞極性調控相關信號通路

肝細胞極性的調節不僅表現在各種結構成分的組成上，同樣重要的還有發生在細胞內外的復雜的分子信號通路。在整個尚未完全闡明的信號網絡中，介紹以下幾種主要通路。

4.1 AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)相關信號通路 TJ是維持細胞極性的關鍵因素之一，而AMPK在其中發揮著關鍵作用。現有研究[25]表明，當AMP/ATP比值升高時，可以通過肝激酶B1磷酸化激活AMPK，促進上皮細胞之間的TJ形成。此外，AMPK還可以影響膽汁分泌。膽汁酸具有信號分子的作用，可升高細胞內環磷酸腺苷水平。2000年，Ng等[26]首先報道了膽汁酸促進肝細胞極化的現象，發現膽汁酸能夠對大鼠肝癌細胞極性進行可逆性誘導。此外，Fu等[27]使用大鼠原代肝細胞的膠原夾心培養物，評估?；悄懰釋Τ跫壐渭毎麏A心培養模型中極性發展的影響，確定了?；悄懰猁}可通過激活環磷酸腺苷-Eapc-Rap1-絲裂原活化細胞外信號調節蛋白激酶-肝激酶B1-AMPK 通路影響肝細胞極性，表明膽汁酸產生和肝細胞極性之間存在關聯。此外，AMPK還是一種調節能量穩態的細胞能量傳感器，可通過協調多種細胞器及細胞過程以維持肝細胞極化過程的能量需求[28]。

4.2 Wnt/β-catenin通路 經典的 Wnt/β-catenin通路是一種十分保守的信號傳導機制，可調節許多關鍵的生理和病理過程(細胞增殖、分化和極性)。β-catenin通過與α-catenin結合將上皮鈣黏素(E-cadherin)與肌動蛋白細胞骨架連接，在AJ中發揮作用。在特異性敲除β-catenin的肝細胞中，可觀察到γ-catenin基因表達保持不變，但其絲氨酸/蘇氨酸磷酸化水平明顯增加，以補償AJ處β-catenin的缺失[29]。而肝細胞中β-catenin和γ-catenin的雙重丟失，可引起TGFβ通路的激活，進而下調肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4alpha，HNF4α)的水平和活性，從而導致肝細胞極性的喪失[30]。

4.3 抑瘤素M(oncostatin M，OSM) OSM是IL-6家族的多效性細胞因子，可由多種類型細胞產生。OSM參與多種生物過程(造血、成骨、肝臟發育等)。在胚胎中，非極化的肝母細胞在OSM和TNFα的信號刺激下分化為極化的肝細胞[31]。OSM介導的K-ras信號通過改變包括 E-cadherin和β-catenin在內的TJ相關蛋白亞細胞定位來誘導AJ形成。在轉染人重組OSM的HepG2細胞中，觀察到EMT過程相關變化，如細胞間接觸廣泛喪失以及E-cadherin表達下調[32]，提示OSM介導的信號通路與肝細胞極性的調節有關。

5 轉錄因子對肝細胞極性的影響

HNF4α作為一種轉錄因子，對哺乳動物肝臟發育過程中的肝細胞分化必不可少。HNF4α表達失調與多種肝病(肝硬化、HCC)有關[33]。缺乏HNF4α的肝細胞沒有進行正常的細胞接觸，細胞黏附和連接發生廣泛障礙，導致肝體積增大并伴有明顯的脂肪變性[34]，提示HNF4α能夠通過調節黏附及連接相關蛋白表達水平進而影響肝細胞極性的維持。此外，在HCC肝組織中，HNF4α表達顯著降低，HCC中細胞-細胞和細胞-ECM黏附減少，細胞極性喪失，端粒酶活性增加以及肝臟特異性基因表達受到抑制[35]。

6 微小RNA(microRNA，miRNA)對肝細胞極性的影響

miRNA是一種非編碼小RNA，通過與mRNA結合而干擾翻譯過程。miRNA能夠影響AJ和TJ蛋白的表達以及細胞骨架重塑。但是，關于miRNA在肝細胞極性的建立和維持中的具體作用及相關機制尚不清楚。在HCC患者癌組織中，多種miRNA表達水平發生改變。研究[36]發現，miRNA-144可通過與?；撬嵘险{基因1相互作用激活JAK2/STAT3通路，促進HCC細胞的增殖和轉移，而牛磺酸上調基因1敲低通過使JAK2/STAT3通路失活上調miRNA-144來抑制HCC腫瘤生長。

7 肝細胞極性與肝臟疾病

7.1 病毒性肝炎 研究[37]發現，在HCV感染的HepG2細胞中，HCV與細胞兩側端均有結合，但感染主要發生在基底外側區域，且新合成的子代病毒優先從基底外側區域釋放。另有研究[38]證實，TJ蛋白在HCV感染過程中發揮重要作用。HCV進入肝細胞與多種因子相關，包括B1型清道夫受體(scavenger receptor B1，SR-B1)、分化簇81、表皮生長因子受體、CLDN1和閉合蛋白。

CD81缺少膜信號序列，但可聚集在細胞膜微區中，并參與多種細胞功能，如細胞黏附、遷移和增殖等。但值得一提的是，與其他宿主因子(如低密度脂蛋白受體或SR-B1)的相互作用可能需要誘導HCV糖蛋白E2的構象變化以暴露CD81結合位點。SR-B1作為脂蛋白受體，可直接與E2結合發揮作用。LDLR不與E2結合促進病毒攝入，而是與HCV脂質病毒顆粒中的天然配體低密度脂蛋白結合促進病毒RNA的復制。CLDN1可以與HCV糖蛋白E1/E2異二聚體結合，同時可以與CD81結合形成復合體，促進病毒內吞過程。HCV最初附著于表面蛋白多糖和脂質受體上如SR-B1和CD81。當病毒漸漸靠近TJ處時，CLDN1和閉合蛋白對病毒的入吞至關重要[39]。

7.2 肝細胞癌(HCC) 大多數癌癥是上皮細胞形成的，而極性的缺失被認為是癌癥的標志和先決條件[40]。肝細胞極性的紊亂和喪失導致細胞黏附和連接的減弱，誘導EMT，最終促進HCC的發展和轉移。其中，E-cadherin作為AJ的主要成分之一發揮著關鍵作用。E-cadherin在肝癌中的下調可由不同的機制引起。CD147是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在肝腫瘤細胞中高表達，主要分布在細胞基底外側。CD147不僅能夠促進TGFβ1介導的肝細胞極性喪失，還能夠通過激活Src募集泛素連接酶直接誘導E-cadherin的泛素化和溶酶體降解，導致極性蛋白Par3表達減少和黏性連接蛋白β-catenin核易位，從而促進肝細胞去極化[41]。空泡蛋白分選蛋白33B(vacuolar protein sorting 33B，VPS33B)在維持肝細胞極性和HCC發生發展中也起著關鍵作用。VPS33B與肝細胞頂-基底外側極性調節蛋白VIPAR、囊泡轉運蛋白Sec22b和筏蛋白-1相互作用，調節和維持極性蛋白的分布。當VPS33B缺失時，可導致E-cadherin蛋白水平的降低，誘導肝損傷、進行性肝炎、肝纖維化和HCC[42]。此外，神經生長因子是一種重要的神經營養因子，對神經元細胞的生長和存活至關重要。有研究[43]在構建穩定過表達神經生長因子的HepG2細胞系后，觀察到HepG2細胞中神經生長因子過表達可破壞細胞極性，從而啟動EMT并促進癌細胞運動。上述證據提示，肝細胞極性穩定受到破壞后，可促進HCC的發展、浸潤和轉移。

7.3 膽汁淤積性肝病 膽汁淤積性肝病是指由于膽汁的生成、分泌或流動發生障礙，導致肝內外膽管中膽汁積聚，進而造成肝損傷。如前所言，肝細胞極性是肝細胞正常行使功能的基礎，而肝細胞的一項重要功能即為負責產生和分泌膽汁。如果肝細胞極性穩定受到破壞，肝細胞內蛋白質定位發生異常，將導致肝細胞無法正常分泌膽汁，膽汁分泌量減少。膽汁鹽從肝臟的轉運是由位于小管膜上的膽鹽輸出泵介導的，膽鹽輸出泵缺乏往往是進行性家族性肝內膽汁淤積癥2型的主要原因[44]，患者往往在幾年內進展為終末期肝病。此外，TJ蛋白異常也將導致膽汁淤積性肝病的發生。TJ蛋白2(TJP2)基因突變及其翻譯產物ZO-2缺乏可引起嚴重的肝內膽汁淤積[45-46]。驅動蛋白超家族是一類在胞內負責運輸物質的分子馬達，與細胞極性有關。致病性驅動蛋白超家族成員12變異引起肝細胞極性紊亂，可導致膽汁淤積性肝病的發生[47]。膽汁淤積性肝病的發病機制往往被認為是肝細胞極性紊亂的結果，目前已經確定多種蛋白質/基因與肝細胞極性紊亂所致膽汁淤積性肝病相關，詳見表1。

表1 肝細胞極性紊亂所致膽汁淤積性肝病相關蛋白質/基因

8 展望

肝細胞極性的建立和維持涉及多種蛋白質分子及信號通路，了解其中具體分子機制對于與肝細胞極性相關疾病的預防和治療有著重大意義。眾多蛋白質分子在行使其正常功能前，需在胞質內質網中完成翻譯后修飾這一過程，包括糖基化、磷酸化、甲基化等修飾形式。葡萄糖基-半乳糖基-羥基化是一種重要的翻譯后修飾，主要在含有膠原蛋白樣結構域的蛋白質中觀察到，如膠原蛋白、脂聯素等。前膠原半乳糖基轉移酶1是前膠原蛋白進行葡萄糖基-半乳糖基-羥基化的一種糖基轉移酶，負責將半乳糖基轉移至前膠原蛋白特定羥化賴氨酸殘基上。此外，包括鈣黏蛋白在內的多種細胞連接蛋白也需要進行N-糖基化等翻譯后修飾。由于膠原蛋白和蛋白聚糖是構成ECM的核心結構，蛋白質的糖基化修飾可能是決定肝細胞極性發育及維持的關鍵。肝細胞小生境(niche)功能調控研究，在很大程度上決定了肝細胞極性的調控，其中膠原蛋白Glcα1和2Galβ1-等O-糖基化修飾對ECM小生境的影響，可能是未來肝細胞極性分子機制闡述的重要研究方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：毛元鵬負責擬定寫作思路，資料分析，撰寫論文；魏紅山負責課題設計，指導撰寫論文并最終定稿。