風輪菜染色體數目及核型分析

楊東娟，陳春意，王順安

（韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041）

風輪菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze 又名熊膽草、苦地膽、九層塔等，民間又稱為神仙草.為唇形科風輪菜屬多年生草本植物，生于海拔1 000 m 以下的山坡、草叢、路邊、灌叢或林下［1］.風輪菜屬植物約有20 種，分布于歐洲、中亞和亞洲東部.我國共有11 種、5 個變種和1 個變型［2］，主要分布于江蘇、江西、湖南、廣東、云南等地.該屬植物具有收斂止血之功效，多為民間用藥，主要用于治療崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創傷出血等出血癥及單純性紫癜、原發性血小板減少性紫癜等癥［3］.也作為菜肴食用，深受人們喜愛［4］.

風輪菜的營養成分豐富，含有大量的微量元素、氨基酸、多糖、總黃酮等成分.對風輪菜的現有研究主要集中在其化學成分、藥理、食用功能等方面，但至今未見有關風輪菜染色體等遺傳信息方面的研究報道.因此，本實驗首次對風輪菜進行染色體數目與核型研究，為更好地研究開發風輪菜資源及其進化、遺傳育種等方面提供一定的細胞學依據.

1 材料和方法

1.1 材料

風輪菜采自潮州市湘橋區慧如公園，取其莖段扦插，一周后長出根系.

1.2 實驗試劑與儀器

0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液、Carnoy 固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）、纖維素酶、果膠酶、磷酸緩沖液（pH=7.2）、Giemsa 染液；FA2004N 型電子分析天平、Olympus CX31RTSF 型光學顯微鏡、Canon Power Shot G12型數碼相機.

1.3 實驗方法

待扦插的風輪菜根長至1 cm 左右，于上午8∶00-10∶30時取其帶根冠的健康根尖約0.5 cm 長，放入預冷的濃度為0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液4 ℃低溫處理2-5 h，蒸餾水清洗后轉入固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）固定12 h以上，然后按照Zhuang［5］所用酶解方法制片：將根尖用4%纖維素酶與1%果膠酶混合酶液酶解1.5 h左右，蒸餾水低滲20 min后將根尖放置在干凈的載玻片上，用鑷子夾取固定液迅速搗碎使細胞分散［6-7］，酒精燈略微過火，過夜晾干后用Giemsa染液扣染30 min.顯微鏡下觀察，拍照.選取50個染色體數目明確、形態清晰的中期分裂相，進行染色體計數，以確定其數目和倍性.

1.4 核型分析

選取3 個染色體數目和形態清晰的分裂相細胞進行核型分析，按照染色體的大小和形態特征對其進行分組、排序以及同源染色體的配對.測量染色體的長臂和短臂值，并根據公式計算染色體的相對長度（染色體相對長度=每條染色體長度/染色體組總長度×100%）、染色體不對稱系數（染色體不對稱系數=染色體長臂總長度/染色體組總長度×100%）、相對長度系數（相對長度系數=每條染色體的相對長度/染色體的平均相對長度）和臂比（臂比=長臂/短臂）.參照李懋學［8］的標準進行染色體核型分析，參照Levan等［9］對染色體類型的分類系統確立核型公式，參照Stebbins［10］對核型類型的分類標準確定染色體核型類型，參照Arano［11］的方法計算核型不對稱系數.采用Photoshop CS6 制作染色體核型圖的和測量數據，用Microsoft Office Excel 軟件進行數據處理和與修圖工具相結合制作染色體核型模式圖［12］.

2 結果與分析

2.1 風輪菜染色體數目

根據李懋學和陳瑞陽提出的理論，當85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數目時，即可認為是該植物的染色體數目［8］.本實驗觀察了50 個風輪菜根尖細胞的有絲分裂中期相，其中有44 個細胞的染色體數為66 條，占計數細胞的88%，有4 個細胞染色體數為65 條，2 個細胞染色體數為64 條，因此，確定風輪菜染色體數目為2n=2x=66，體細胞為二倍體，染色體基數為x=33.在觀察中沒有發現多倍體，也沒有發現B染色體的存在，見圖1.

圖1 風輪菜染色體數目及核型圖

2.2 風輪菜染色體長度組成及核型分析

2.2.1 風輪菜核型公式的確定

選取3個染色體形態清晰、分散良好的染色體圖像（圖1），進行分析、配對和測量，取其平均值.根據染色體相對長度公式計算出每對染色體的相對長度，詳細參數見表1.由表1可以看出，風輪菜33對染色體中臂比值為1.00 的染色體有2 對，臂比值在1.01-1.70 之間的有31 對，根據以上數據，可以確定風輪菜的染色體核型公式為K=2n=2x=62m+4M［13］.

2.2.2 風輪菜染色體核型圖的制作

參照楊大翔［14］的方法對同源染色體配對，并用Excel軟件處理表1中所列各染色體數據，用Adobe Photoshop CS6軟件處理圖片并制作染色體核型圖，（見圖2）.

圖2 風輪菜核型模式圖

表1 風輪菜的染色體參數

2.2.3 風輪菜核型分類

由表1 可知風輪菜染色體絕對長度總長為1.362 9 μm，平均絕對長度為0.020 65 μm，染色體長臂絕對長度總長0.732 0 μm.根據染色體不對稱公式計算出風輪菜染色體的不對稱系數為53.71%，因此其對稱程度較高.根據Stebbins［10］的“不對稱核型分析”分類的12 種類型，最長染色體和最短染色體的比值為2.07，沒有臂比大于2∶1的染色體，風輪菜染色體核型屬于“1B”型，為基本對稱染色體核型.風輪菜的染色體相對長度系數組成為2n=66=2L+30M2+30M1+4S，染色體的相對長度差異不是很大.

3 討論和結論

目前，對風輪菜染色體數目及核型分析的研究還未見報道.本研究通過對風輪菜染色體的數目及核型分析，確定風輪菜的染色體數目為2n=66，核型公式K=2n=2x=62m+4M.風輪菜染色體平均絕對長度為0.020 65 μm，屬于小染色體，且各染色體的形態相似，數目較多，核型分析較困難.本研究在對風輪菜酶解的過程中將溫度控制在56 ℃，酶解效果良好，每條染色體的形態清晰可見，減少了測量誤差，保證了染色體形態結構信息的真實性.

風輪菜染色體臂比變化范圍為1.000-1.389，不對稱系數為53.71%，屬于“1B”型，且根據其染色體相對長度系數得出，風輪菜的核型對稱程度較高.文獻資料表明，染色體對稱的植物屬于相對原始的類型，不對稱者屬于相對進化的類型，因此推測風輪菜的進化程度低，屬于比較原始的類型.在植物進化過程中，其染色體的數目形態等特征相對穩定.同樣，在不同植物的科與科間、亞科與亞科間、屬與屬間、種與種間，以及同種的不同居群中其染色體的大小、形態和結構也具有多樣性.因此，核型分析可為研究生物的系統發育和近緣關系提供依據.與單純的形態分類相比，染色體數據更可以解決常規形態分類難以解決的問題［15］.