干擾長鏈非編碼RNA TUG1緩解卵清蛋白誘導的哮喘小鼠肺功能損傷和纖維化以及免疫紊亂

任彥紅 張凌云 趙少聰 張廣超 孫曉敏

哮喘是一種以中性粒細胞等免疫細胞介導的炎癥狀態，隨病程的延長可產生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑，嚴重影響患者的健康[1]，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在人類生理與病理中發揮重要作用，與多種疾病密切相關[2]。其中，調節lncRNA TUG1能緩解缺血-再灌注誘導的腎小管上皮細胞炎癥和凋亡[3]，減輕子宮內膜纖維化和炎癥[4]，抑制大鼠脊髓缺血再灌注后的炎癥損傷[5]。此外，基于前期lncRNA TUG1通過海綿miR-590-5p/FGF1促進哮喘患者氣道平滑肌細胞的增殖和遷移的研究[6]，提示干擾長鏈非編碼RNA TUG1對治療哮喘有巨大的潛力及重要的意義。因此，本實驗探討干擾長鏈非編碼RNA TUG1對卵清蛋白誘導的哮喘小鼠肺功能損傷、纖維化以及免疫紊亂的影響，以期為哮喘的臨床治療提供數據參考。

資料與方法

一、材料與儀器

1 實驗動物 SPF級Wistar小鼠，四周齡，雄性，體質量25～30 g,動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。

2 藥物與試劑 卵清蛋白，美國Sigma-Aldrich公司；PCR試劑盒、SDS-PAGE蛋白凝膠、細胞裂解液、Trizol試劑，北京索萊寶科技有限公司；總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒、英國Abcam公司；PBS磷酸緩沖液、生理鹽水、多聚甲醛，北京萬佳首化生物科技有限公司；Masson膠原染色試劑、蘇木精-伊紅染色試劑、瑞氏-吉姆薩染色，北京雷根生物技術有限公司；α-SMA、FN、TGF-β1相關抗體，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；IFN-γ、IL-4等引物，引物設計參考序列均來源于NCBI及Ensembl數據庫，合肥知恩生物技術有限公司；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒、γ干擾素(IFN-γ)試劑盒、白介素-4(IL-4)試劑盒、白介素-10(IL-10)試劑盒，武漢默沙克生物科技有限公司；AKT等相關抗體，上海碧云天生物技術有限公司。

3 主要儀器 Rt2100c酶標儀，美國BioTeK公司；430c霧化吸入器，上海魚躍醫療設備有限公司；C100自動細胞計數儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；KL-B2型石蠟包埋機、S700A石蠟切片機，湖北康龍電子科技有限責任公司；ICX41倒置顯微鏡，舜宇光學科技有限公司；Microfuge 20低溫高速離心機，美國BECKMAN公司；HS1800H-U/W超凈工作臺，成都市蘇凈科學器材有限公司；AniRes2005動物肺功能分析系統，北京貝蘭博科技公司；SY00992大小鼠體描箱，雙玉儀器設備有限公司。

二、方法

1 動物與處理 將小鼠隨機分為四組，正常對照組(Control)、模型組(OVA)、陰性對照組(OVA+shRNA-NC)、干擾組(OVA+sh-TUG1)。參考文獻建模[7]，除正常組注射及霧化吸入相同體積生理鹽水外，各組小鼠分腹腔注射0.2mL 1% OVA致敏液, 1周/次，共3次；致敏完成后進行激發，將小鼠置于密閉容器中，5 mL 5% OVA溶液霧化吸入30 min/d，共7 d，建立哮喘動物模型，其中陰性對照組及干擾組小鼠每次在激發前分別腹腔給予2.5 mg/kg shRNA-NC及sh-TUG1，正常對照組及模型組給予相應體積生理鹽水。

2 肺功能指標檢測 各組小鼠在麻醉狀態下進行氣管插管，在體描箱內記錄靜息狀態下呼吸通氣量，并檢測氣道阻力改變、肺容積變換指標。

3 支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織的收集 各組小鼠在麻醉狀態下，用1 mL注射器將預冷的PBS緩沖液通過氣管插管緩慢的灌注至雙肺，反復沖洗3次，保證灌洗液回吸收率在90%以上。將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar fluid，BALF)進行離心(4 ℃、1200 r/mim、10 min)并凍存；眼球取血，離心收集上清液；及時解剖，取肺組織，一部分進行蠟塊包埋，用于病理形態學觀察，剩余部分凍存，用于后續組織蛋白的提取。

4 HE染色觀察肺組織 取出包埋處理的組織，用刀片修蠟，組織切片機切片。經水浴展平、將蠟帶貼在載玻片上進行烘干。二甲苯脫蠟后，進行蘇木精-伊紅染色，封片后在顯微鏡下觀察結果。

5 Masson染色觀察肺纖維化 取出包埋處理的組織，進行組織切片，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度酒精脫水，Masson膠原染色試劑染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在顯微鏡下觀察結果。

6 WB檢測肺纖維化指標水平 剩余肝組織制備成勻漿，提取總蛋白。BCA試劑盒進行總蛋白定量，電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST沖洗，加入二抗，TBST沖洗3次，ECL顯影后分析灰度值，實驗重復3次。

7 試劑盒檢測肺組織中HYP含量 取小鼠肝組織剪碎，加入提取液在110℃烘箱內消化6 h ,離心過濾后調節PH為7左右，將標準品梯度稀釋，按照HYP含量檢測試劑盒進行操作，混勻后水浴20 min，再靜置至室溫，取溶液在96孔板中，調節波長560nm，酶標儀檢測。

8 哮喘小鼠肺組織炎癥評分 炎癥評分表評估肺組織的炎癥程度，參考Underwood標準[8]。

9 檢測BALF液中炎癥細胞計數情況 BALF液離心后，用PBS重懸。采用血細胞計數板檢測總的炎癥細胞，取重懸液滴于防脫載玻片上根據試劑盒說明書采用瑞氏-吉姆薩染色來分類，計算各細胞數量。

10 ELISA檢測BALF液中炎癥因子含量 分別按照iNOS 、IFN-γ 、IL-4 、IL-10試劑盒說明書操作，用酶標儀進行檢測。

11 RT-PCR檢測BALF液中炎癥因子水平 BALF液離心后，用PBS重懸后，用Trizol法提取總的RNA，并測定濃度，按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis kit 逆轉錄試劑盒的說明進行操作，加入相應引物及樣品，每組設置三個復孔。用2-△△Ct法計算iNOS mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-10 mRNA的相對表達水平。

12 WB檢測肺組織中AKT/NF-κB通路的相關蛋白表達 采用AKT、p65等相關一抗，根據2.6的操作進行。

三、統計學分析

結 果

一、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肺功能損傷的影響

與Control組相比，OVA模型組小鼠的肺容積、靜息通氣量、氣道阻力均顯著降低(P<0.05，見圖1)；與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠的肺容積、靜息通氣量、氣道阻力均顯著升高(P<0.05，見圖1)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能緩解OVA小鼠肺功能損傷。

圖1 各組對OVA小鼠肺功能損傷的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

二、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肺組織HE染色的影響

Control組小鼠肺組織結構清晰，未見病理形態變化，支氣管壁膠原層較薄；OVA模型組肺組織結構明顯破壞，肺泡壁結構紊亂，肺泡間隔增厚，肺泡腔縮小，炎性浸潤明顯；OVA+shRNA-NC組的病理程度與OVA模型組接近；OVA+sh-TUG1組對上述病理狀態有一定的緩解，小鼠的肺組織炎性細胞浸潤區域較少，肺組織結構完整(見圖2)。結果提示：干擾lncRNA TUG1能改善OVA小鼠肺組織的病變程度，緩解OVA小鼠肺部損傷，與3.1結果吻合。

圖2 各組對OVA小鼠肺組織HE染色的影響(×100)

三、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肺纖維化的影響

Control組小鼠肺組織僅有少量膠原，肺泡結構完整，無肺泡內出血；OVA模型組小鼠肺泡內肺泡結構消失，膠原蛋白圍繞氣管和肺泡大量增殖，導致正常肺泡結構消失或黏連；OVA+shRNA-NC組的纖維化程度與OVA模型組接近；OVA+sh-TUG1組對上述膠原蛋白異常增殖狀態有一定的緩解(見圖3A)。

與Control組相比，OVA模型組小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表達顯著升高(P<0.05，見圖3B-C)；與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表達均顯著降低，P<0.05。(見圖3B-C)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纖維化程度。

圖3 各組對OVA小鼠肺纖維化的影響(×100)與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

四、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肺組織羥脯氨酸(HYP)含量的影響

HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，其含量反映膠原組織代謝及纖維化程度。與Control組相比，OVA模型組小鼠的HYP含量顯著升高，P<0.05(見圖4)；與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠的HYP含量均顯著降低(P<0.05)(見圖4)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能減少HYP代謝，降低OVA小鼠肺纖維化程度，與3.3結果吻合。

圖4 各組對OVA小鼠肺組織HYP含量的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

五、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肺組織炎癥評分的影響

與Control組相比，OVA模型組小鼠的肺組織炎癥評分顯著升高(P<0.05)(見圖5)。與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠肺組織炎癥評分顯著降低(P<0.05，見圖5)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能明顯緩解OVA小鼠的炎癥損傷。

圖5 各組對OVA小鼠肺組織炎癥評分的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

六、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠BALF液中各項細胞指標計數情況

與Control組相比，OVA模型組小鼠的炎癥細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數目顯著增加(P<0.05)(見圖6)。與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠以上各項炎癥細胞數目均顯著減少(P<0.05)(見圖6)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能明顯緩解OVA小鼠的炎癥損傷，與3.5結果吻合。

圖6 各組對OVA小鼠BALF液中各項細胞指標計數的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

七、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠BALF液中炎癥指標含量的影響

與Control組相比，OVA模型組小鼠的iNOS、IFN-γ、IL-4、IL-10含量均顯著升高(P<0.05)(見圖7)。與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠的促炎因子iNOS 、IFN-γ含量均顯著降低(P<0.05)(見圖7A)。抗炎因子IL-4、IL-10含量均顯著升高(P<0.05)(見圖7B)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能明顯改善OVA小鼠的炎癥程度，與3.5、3.6結果吻合。

圖7 各組對OVA小鼠BALF液中炎癥指標含量的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

八、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠BALF液中炎癥指標mRNA表達的影響

與Control組相比，OVA模型組小鼠的iNOS mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-10 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)(見圖8)。與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠的促炎因子iNOS mRNA、IFN-γ mRNA表達均顯著降低(P<0.05)(見圖8A)。抗炎因子IL-4 mRNA、IL-10 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)(見圖8B)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能明顯改善OVA小鼠的炎癥程度，與3.5、3.6、3.7結果吻合。

圖8 各組對OVA小鼠BALF液中炎癥指標mRNA表達的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

九、干擾lncRNA TUG1對OVA小鼠肝臟中AKT/NF-κB通路相關蛋白的影響

與Control組相比，OVA模型組小鼠的p-AKT/AKT、p-P65/P65相對蛋白的表達顯著升高；與OVA模型組相比，OVA+shRNA-NC組差異無統計學意義，OVA+sh-TUG1組小鼠p-AKT/AKT、p-P65/P65相對蛋白表達均顯著降低(P<0.05)(見圖9)。結果提示，干擾lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纖維化程度，其機制可能與調控AKT/NF-κB通路的相關蛋白有關。

圖9 各組對OVA小鼠肝臟中AKT/NF-κB通路相關蛋白的影響與Control組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05

討 論

近年來研究顯示，lncRNA是研究呼吸系統疾病中的熱門方向，具有參與基因調控，阻斷或促進疾病發展的潛力，其中lncRNA與哮喘的研究密切相關[9]，可作為臨床判斷、評估預后的生物學指標以及后期治療的靶點[10]。Fan等[11]發現lncRNA TCF7通過靶向TIMMDC1/Akt參與哮喘氣道平滑肌細胞的生長和遷移；Zhang等[12]的研究表明干擾lncRNA-AK149641的會緩解OVA誘發的哮喘小鼠模型中的氣道炎癥反應，這可能與NF-κB信號通路的調節有關。此外，基于前期lncRNA TUG1對哮喘患者氣道平滑肌細胞的增殖和遷移的研究。本實驗探討干擾長鏈非編碼RNA TUG1對卵清蛋白誘導的哮喘小鼠肺功能損傷、纖維化以及免疫紊亂的影響。

肺功能檢查是呼吸系統疾病的不可或缺的檢查，廣泛用于疾病診斷、病情分級、疾病發展、預后評估、治療方案選擇、療效評估等，具有重要的臨床意義[13]。HE染色是觀察肺組織細胞成分與病變形態結構的常用方法。Zhang等[14]指出干擾lncRNA BCYRN1增加了OVA大鼠的肺容積、靜息通氣量，緩解肺組織的病變程度，減輕了哮喘對肺的損害。Hu等[15]發現LncRNA TUG1逆轉LPS誘導肺損傷，HE檢測顯示肺組織的病理程度減輕。本實驗顯示，OVA+sh-TUG1組小鼠的肺容積、靜息通氣量、氣道阻力均顯著升高，小鼠炎性細胞浸潤區域較少，肺組織的病變程度減輕，提示干擾lncRNA TUG1能緩解OVA小鼠肺功能損傷，與上述研究一致。

哮喘常見的肺部免疫介導性疾病。具有氣道高反應性、嗜酸性粒細胞增多、炎性因子增強、細胞浸潤，杯狀細胞及黏液增加等特征。長期反復慢性哮喘會導致皮下肺纖維化[16]。大量研究已證明，香草素受體4型瞬時感受器電位通道(transient receptor potential vanilloid 4 channel, TRPV4)的相關蛋白會誘導肌成纖維細胞生成，即α-平滑肌動蛋白(Smooth muscle actin,α-SMA)、纖維粘連蛋白(fibronectin, FN)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等促進肺纖維化的發生發展[17]。Huang等[18]指出lncRNA FENDRR主要通過下調TGF-β1表達，抑制肺成纖維細胞活化，從而減少肺纖維化，改善肺功能。Zhang等[19]的報道，顯示干擾lncRNA NEAT1可增強E-鈣粘蛋白的表達，并降低TGF-β1、p-Smad2、α-SMA的表達，通過調節miR-9-5p和TGF-β信號來抑制上皮細胞-間充質轉化，從而緩解肺纖維化。HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，目前測定肺臟羥脯氨酸的含量是評價肺纖維化程度的常用方法，是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標[20]。Qu等[21]研究表明肺纖維化程度與HYP含量呈負相關。本實驗顯示，OVA+sh-TUG1組小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表達均顯著降低、HYP含量顯著減少，提示，干擾lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纖維化程度，與上述研究一致。

統計肺泡灌洗液(BALF)中淋巴細胞(lymphocyte,LYM)、中性粒細胞 (Neutrophils, NEU) 、 嗜酸性粒細胞(Eosinophils, EOS)等免疫細胞數目是檢查呼吸系統疾病的常用方法。其中，Wang等[22]指出肺組織中的免疫細胞(NK細胞、單核細胞、中性粒細胞等)可以反映疾病的嚴重程度并參與肺纖維化的發展。Zhang等[12]的研究表明OVA小鼠的總細胞數和嗜酸性粒細胞數顯著增加，而lncRNA AK149641的下調顯著降低了炎癥細胞的浸潤。Nakagome等[23]研究顯示體內IL-10基因傳遞通過抑制肺中TGF-β的生成和激活，減弱博萊霉素誘導的肺纖維化。Liu等[24]指出LncRNA-CASC7通過靶向miR-21抑制PI3K/AKT信號通路，抑制相關炎性因子表達，緩解哮喘的發生。本實驗顯示，OVA+sh-TUG1組小鼠肺組織炎癥評分降低、各項炎癥細胞數目減少、促炎因子表達降低、抗炎因子表達升高。結果提示，干擾lncRNA TUG1能明顯緩解OVA小鼠的免疫紊亂，與上述研究一致。

哮喘的特征在于氣道的炎癥反應。山奈酚通過抑制p65、IκB、AKT的磷酸化以及HO-1的表達，調節 AKT/NF-κB信號通路，在哮喘中發揮抗炎作用的分子機制[25]。本實驗顯示OVA+sh-TUG1組小鼠p-AKT/AKT、p-P65/P65相對蛋白表達均顯著降低。與上述研究一致，結果提示，干擾lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纖維化程度，其機制可能與調控AKT/NF-κB通路有關。

綜上，干擾lncRNA TUG1能緩解OVA小鼠肺功能損傷、肺纖維化程度及免疫紊亂，具有靶向治療哮喘的潛力，其機制可能與調控AKT/NF-κB通路的相關蛋白有關。