代謝組學在兒童哮喘中的應用進展

吳銳劍，黃宇戈，羅連響

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其特征是可逆性氣流受限和氣道高反應性，臨床表現為反復發作的喘息、咳嗽、胸悶和氣促［1］。哮喘是兒童最常見的慢性疾病［2］，其發病與飲食、遺傳、微生物和環境等因素相關［3］，具體發病機制尚未明確。目前臨床主要根據臨床癥狀、體征、肺功能和呼出氣一氧化氮（FeNO）等進行診斷及病情評估。我國兒童哮喘流行病學調查結果顯示，城市兒童哮喘的漏診率達30%［4］。而且目前臨床上哮喘常用的輔助檢查——肺功能和FeNO 無法監測肺部炎癥情況，亦不能預測病情惡化。代謝物是生物學和環境因素共同作用的結果，具備將基因型和表型聯系起來的巨大潛力，代謝組學有助于從整體上識別和量化生物體內的代謝物變化。

代謝組學是對生物體液、細胞、組織、器官或生物中的低分子量分子或代謝產物進行客觀地整體測量［5］。以往人們主要將代謝物視為下游產物，即生物標志物，隨著對代謝物的深入了解發現，代謝物不僅是疾病的生物標志物，依據各自酶的活性其還可以修飾蛋白質和DNA，并與之相互作用，從而改變蛋白質組和表觀基因組［6-7］（圖1）。代謝物可作為信號分子來控制轉錄因子，進而控制基因表達；此外，代謝物作為染色質修飾酶的輔助因子和輔助底物，積極參與表觀遺傳調控。代謝物還通過核糖開關傳感小分子配體和轉錄后修飾影響RNA 代謝。最后，代謝物通過跨膜受體和轉錄因子的變構調節，作為生化反應催化中的輔酶因子和共底物，以及通過翻譯后修飾，來主動控制蛋白活性。因此，代謝組學不僅能為臨床提供哮喘的潛在生物標志物，還有助于進一步了解哮喘的發病機制。

圖1 代謝物與表觀基因組、蛋白質組的相互作用Figure 1 Interactivities of metabolite with epigenome and proteome

目前哮喘相關的代謝組學研究主要是針對成人哮喘，兒童哮喘相關的代謝組學研究相對較少。兒童生理特點與成人不同，兒童處在生長發育階段，器官發育尚未成熟，功能尚未完善，兒童代謝水平有其自身特點。例如，成人哮喘患者的血清精氨酸高于非哮喘者［8］，而在兒童中結果正好相反［9］，這可能由兒童免疫系統不成熟導致［8，10］。與成人相比，兒童更易受遺傳、性別［11］、年齡［12］、體質指數（BMI）［13］、飲食［14］、藥物［15］、外界環境等因素影響，因此，需嚴格控制研究人群的人口學特征。此外，代謝組學在兒童哮喘中的意義不僅局限于哮喘的診斷，還包括哮喘的預測，本文對代謝組學在兒童哮喘中的應用進行綜述，以期在疾病早期對患兒進行干預，從而獲得更好的預后。

1 代謝組學技術與分析

代謝組學按研究策略可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。非靶向代謝組學是對特定環境、特定生理狀態下生物實體代謝物組成的分析［16］，其目的在于對所有代謝物進行分析并從中篩選差異代謝物。而靶向代謝組學則是依賴于先驗代謝物及其生化途徑對特定的代謝物進行定量分析，重復性更好、靈敏度更高［17］。

獲取代謝組學數據的兩種最常見的分析方法是核磁共振光譜（NMR）和質譜（MS）。NMR 是基于能量吸收和由于外部磁場變化而使原子核重新發射的原理的光譜技術［18］，其優勢在于具有很高的可重復性和定量性，且不會對樣本造成破壞，但與此相對的是靈敏度較低［19］。MS 通過質荷比（m/z）和離子化合物通過相對強度獲取光譜數據［20］，具有很高的靈敏度和特異度以及良好的動態范圍，這使其特別適合靶向代謝組學研究。代謝組學中MS 的主要弱點之一是定量分析，所用樣品制備類型及其分子環境會影響信號強度［21］。基于MS 的代謝組學通常在分離步驟之后進行，這會降低生物樣品的復雜性，并允許在不同時間對不同分子集合進行MS分析［18］。MS 技術中最常用的分離技術是液相色譜（LC）和氣相色譜（GC）色譜柱，分別稱為LC-MS 技術和GC-MS 技術［22］。GC-MS 相對穩定、靈敏度高，具有出色的分離再現性，使用商業數據庫和軟件即可輕松鑒定代謝物，但樣品前處理工作量大，只能鑒定易揮發物質且難以進行新的化合物；而LC-MS 技術具有更高的靈敏度、更廣泛的代謝物檢測范圍和多樣化的方法，但穩定性更差，化合物鑒定更困難［23］。

2 代謝組學在兒童哮喘中的應用

代謝組學研究最常用的樣本包括呼出氣、尿液、糞便、血液（血清和血漿），肺泡灌洗液和痰誘導樣本由于其侵入性及技術的復雜性，在臨床取樣時較少見。樣本選擇取決于研究問題的相關性和實際操作的可行性。關于不同樣本的生理特征、優缺點以及相關注意事項詳見表1。

表1 代謝組學常見檢測樣本的比較Table 1 Comparison of common samples for metabonomics analysis of childhood asthma

2.1 血漿和血清代謝組學 血漿和血清是代謝組學分析使用最廣泛的樣本類型，用于研究各種疾病以揭示潛在的生物標志物。兩者均有很好的重現性，且兩者之間有很高的相關性，但血清樣品的濃度、靈敏度和可靠性更高［33-34］。血漿和血清相比其他類型的樣本，優勢在于能反映樣本采集時生理狀態的全局視圖，但缺點在于差異缺乏組織特異性。CHECKLEY 等［35］在一項包含100 名兒童的病例對照研究中使用LC-MS 技術對血清中的18 種代謝物進行代謝組學分析發現，哮喘患兒的還原型谷胱甘肽濃度比對照組高70%。谷胱甘肽是一種三肽硫醇，能通過谷胱甘肽過氧化物酶清除自由基，并與呼吸道反應性以及炎癥調節有關。哮喘患者肺部和血液中的谷胱甘肽升高是對相關氧化應激的適應性反應［36］。FITZPATRICK 等［37］在兒童血漿樣本中使用了非靶向LC-MS技術來區分輕度和重度哮喘，并確定了與哮喘嚴重程度相關的兩個代謝途徑：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑以及N-酰基乙醇胺和N-酰基轉移酶途徑。絲氨酸是包括甘氨酸和半胱氨酸在內的幾種氨基酸的前體，甘氨酸和半胱氨酸是重要的抗氧化劑谷胱甘肽的必須成分。N-酰基乙醇胺磷脂是由膜相關的N-酰基轉移酶形成的，可響應細胞損傷而代謝為N-酰基乙醇胺，并在信號轉導和抗氧化應激的細胞保護中發揮重要作用。兒童重度哮喘可能與抗氧化劑谷胱甘肽失衡有關［38］，患兒氣道［39］和體循環［40］中的谷胱甘肽水平降低，導致氣道炎性增加和細胞功能受損。在成人研究中，哮喘患者體循環中的谷胱甘肽水平較正常人降低，但并無明顯差異［41-42］，這可能與紅細胞對氧化應激的補償反應有關［43］；有趣的是，在COMHAIR 等［41］的研究中，患有嚴重氣流受限的哮喘患者傾向于增加血清谷胱甘肽，這與CHECKLEY 等［35］在哮喘兒童中的研究一致。

2.2 呼出氣代謝組學 近幾年，呼出氣中代謝成分的分析受到廣泛關注，因為其是一種非侵入性的方法，具有提供有關下呼吸道有價值的臨床信息的潛力。目前兒童哮喘領域中大多數研究應用GC-MS 技術來研究單個呼吸中含有的揮發性有機化合物（VOC）或使用電子鼻（eNOSE）技術來研究VOC混合物，這些化合物來源可以是外源（細菌）或內源（細胞）。盡管GC-MS 存在需要訓練有素的研究人員和無法獲得實時在線調查結果的缺點，其仍然被認為是呼出氣分析的“金標準”，因為其能夠識別化合物，從而深入了解病理生理過程，并驗證檢測到的化合物的來源［44］。而eNOSE 技術快速、便宜、容易使用，因此是一種具有吸引力的護理技術［44］。一項前瞻性研究使用GC-MS 技術分析VOC 發現，6 種VOC的組合能預測兒童哮喘的惡化（靈敏度：100%，特異度：93%）［45］，VOC 以烴類為主。另一項針對兒童的前瞻性研究表明，VOC 分析（GC-MS 法）可以準確地預測采樣后14 d 的哮喘發作（靈敏度：88%，特異度：75%）［46］，VOC 包含了3 種醛類、1 種烴類，與前一研究相似。醛類和烴類化合物均與氧化劑對細胞膜中不飽和脂肪酸的損傷有關［47-49］。在成人中也有類似研究，用于預測停止吸入皮質類固醇后哮喘的控制［50-51］，正確分類率可達95%，有助于患者的哮喘檢測和管理。得益于無創、易于獲得且能反映氣道生理的優勢，呼出氣代謝組學在監測氣道炎癥方面的潛力巨大。

2.3 腸道代謝組學 腸道代謝組學在探索腸道菌群對健康的廣泛影響中受到了越來越多的關注，糞便是一種非侵入性樣本，是腸道消化過程的最終產物［52］，越來越多的研究表明，腸道微生物在哮喘發展中發揮著重要作用［53］。CHIU 等［54］通過NMR 技術對85 名兒童的糞便進行代謝組學分析發現，糞便丁酸鹽的減少與螨蟲特異性IgE 水平升高以及兒童哮喘的發生風險有關。而丁酸鹽對哮喘的改善作用，在另外兩篇文獻中得到了進一步證實［55-56］。丁酸鹽是結腸細胞的重要能量來源，對于結腸完整性至關重要［57］。通過保留腸道屏障，丁酸鹽可防止細菌異位至循環系統；此外丁酸鹽通過抑制HDAC 活性來抑制2 型固有淋巴細胞（ILC2）增殖和GATA3表達，從而減少細胞因子IL-5 和IL-13 的產生［58］。在成人中，丁酸鹽被證明能誘導嗜酸粒細胞的凋亡以及抑制嗜酸粒細胞黏附于內皮，并阻止其向嗜酸粒細胞趨化因子-2 的遷移，這可能與組蛋白去乙酰化酶的抑制有關［59］。此外，丁酸鹽還可促進抗原特異性B 淋巴細胞中IL-10 基因的轉錄和IL-10 的表達［60］，而產生IL-10 的B 淋巴細胞具有免疫抑制功能［61］。除丁酸鹽外，多不飽和脂肪酸和膽汁酸均有助于哮喘的改善，而鞘脂和色氨酸代謝物作為潛在的重要途徑值得未來進行深入研究（表2）。腸道代謝物代表宿主和腸道菌群之間的化學相互作用，并具有無創、易于收藏和可重復收集等優勢，但由于腸道代謝物可衍生自宿主、微生物群或包含飲食在內的外源性來源，所以很難查明代謝物的具體來源。

表2 腸道代謝物及其在哮喘發展中的作用機制Table 2 Roles of intestinal metabolites involved in the pathogenesis of childhood asthma

2.4 尿液代謝組學 尿液代謝組學是近年來發現非侵入性生物標志物的一個重要領域，其可以檢測出針對特定疾病或治療干預的細微代謝差異。與其他生物流體相比，尿液的特點是易于收集、代謝產物豐富、能反映體內所有生化途徑的不平衡，并且在腎功能正常的情況下，尿液被過濾、細胞污染程度低［75］。SAUDE 等［76］對135 名兒童的尿液應用靶向NMR，篩選出23 種代謝物鑒別穩定哮喘患兒與健康對照組兒童、28 種代謝物鑒別穩定哮喘患兒與急性哮喘患兒，盡管該研究并沒有將飲食、采樣時間、藥物的使用情況等混雜因素進行亞組分析，但也為后來兒童哮喘的代謝組學研究提供了參考和方向。一項基于兩個獨立的兒童哮喘前瞻性隊列研究發現，哮喘母親所生的健康新生兒在4 周齡時，可以通過尿液樣本中的代謝譜將健康兒童與正在發展為哮喘的兒童區分開，并且兩個出生隊列有14 個重疊的區分特征［77］。其他研究也表明，生命最初幾年的尿液代謝組學譜可預測反復喘息和哮喘［78-79］。與兒童研究不同，成人哮喘尿液代謝組學更多關注哮喘與慢性阻塞性肺疾病（COPD）的鑒別診斷，在ADAMKO 等［80］的研究中，16 種尿液代謝物能將病情惡化1～2 周后的哮喘及COPD 患者進行分類，準確率達94%，對非病情惡化的哮喘患者的陽性預測值為90.9%，這項研究與SAUDE 等［76］的研究有3 個重疊的化合物，分別是二甲胺、葡萄糖和1-甲基煙酰胺，二甲胺與一氧化氮途徑有關［81］，高血糖和1-甲基煙酰胺與哮喘惡化有關［82-83］。與哮喘生物標志物的篩選相比，預測哮喘的發生、發展可能更具臨床意義［84］。

3 代謝組學的局限性

代謝組學為研究環境與宿主之間的相互作用提供了獨特的機會，因為代謝物代表對環境刺激以及上游遺傳和調控修飾（表觀遺傳學、轉錄、翻譯后修飾）的響應，但是，代謝組學本身可能無法捕獲相互作用過程中環境因素特征的范圍或宿主反應的范圍。首先，代謝物的水平受許多混雜因素的影響，例如性別［11］、年齡［12］、BMI［13］、飲食［14］、吸煙、藥物［15］、體力活動、并發癥等；其次，代謝組學研究過程相關操作，例如樣品收集時間［85］、收集程序、前處理［86］、存儲［34］、凍融［87］、提取程序［88］、稀釋、分析方法等，也會對結果造成影響，所以，規范的操作可以減少偏差，增加結果的可靠性；最后，在數據處理過程中，由于變量數常大于樣本數量，所以數據會過度擬合，從而導致錯誤。為解決過度擬合的問題，就需要足夠的樣本量，使用內部交叉驗證或Bootstrapping 算法對模型進行校準，并在獨立的外部樣本中對結果進行驗證。

4 代謝組學的發展方向

遺傳、調控和環境刺激在生物系統中觸發了廣泛的輸入-輸出級聯，疾病的發病機制需要在這種廣泛的生物學系統背景下進行驗證。代謝組學是整合來自各種組學研究（基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組和微生物組）的數據，可能會為在復雜的生物系統背景下理解疾病的發展過程提供更大的機會［89］。盡管單個組學研究得到了大量可訪問的數據，但是通過組學整合來識別新的生物機制尚未達到預期，原因是高度異構數據整合困難，以及目前所謂的大數據集與使用無監督學習方法有效工作所需的數據集相比仍然很小，并且難以達到所需的精度［90］。為了在多組學數據中實現高信息含量，仍需要遵守相關標準，并以高度系統化的方式進行實驗。

其次，通過基于人工智能的機器學習方法，從數據中學習復雜的功能關系，而無需先驗證假設。機器學習模型的原理是在一個生物數據集上訓練，然后使用檢測到的模式來預測另一個。機器學習在典型的生物學應用中分為兩大類，即有監督學習和無監督學習。在有監督學習中，機器學習算法的目標是從已知分組的訓練數據集推算得出疾病的類別，屬于分類算法，其功能是預測；相反，在無監督學習中，目標是從“未標記”的樣本推斷可能的集合，屬于聚類算法，其功能是降維，對樣本間差異較小的特征不敏感。

此外，哮喘是一種復雜而異質的疾病，可分為不同的表型及內型，相同表型的患者，對同一藥物的反應不盡相同。精確的內型是通過特定的生物標志物將病理生物學機制和可見特性聯系起來，其有望將哮喘細分為不同亞型并為個性化治療方案開辟道路。多組學數據為超越臨床表型的內分型提供了機會，特別是與上述機器學習聚類算法結合使用時。將多組學數據與聚類算法結合使用，可以識別同質的哮喘內型，這些內型可能對特定的、個性化的治療方案做出相似反應。

隨著代謝組學技術的發展，不再將代謝物視為下游產物，代謝物除了是飲食、環境、遺傳、微生物共同作用的結果，其還能調控基因表達、RNA代謝和蛋白質活性，在哮喘的發生、發展中發揮作用。通過對血液、呼出氣、糞便、尿液等樣本的檢測，代謝組學可提供生物標志物的篩選、發病機制的闡釋、疾病的預測與分度、呼吸道炎癥的監測。此外，隨著系統生物學的發展，運用多組學融合手段對疾病進行更加全面地研究也逐漸成為趨勢。未來，將基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、微生物組學和生物信息學結合，有利于為兒童哮喘的研究提供可信度更高的數據，并有望借此區分不同哮喘亞型，實現精準醫療和個體化治療。

作者貢獻：黃宇戈、羅連響進行文章的構思與設計，文章的可行性分析；吳銳劍進行文獻的收集、整理，以及撰寫論文；黃宇戈進行文章的質量控制及最終文章的修改，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

本文文獻檢索策略：

檢索Pubmed 數據庫，檢索時間為建庫至2020 年12 月。納入標準：（1）以檢索式metabolomics AND asthma AND （child OR children）檢索相關文獻；（2）盡量以近10 年文獻作為參考文獻。排除標準：（1）重復文獻；（2）與“代謝組學”“兒童”無關文獻；（3）存在研究設計缺陷，質量差的文獻。