百香果內生細菌多樣性及促生長特性

唐嘉城 梁毅珉 馬葭思 彭桂香 譚志遠

（1.華南農業大學農學院，廣州 510642；2.華南農業大學資源環境學院，廣州 510642）

植物內生菌（endophyte）是指在健康植物的細胞間或細胞內存活且可在不同時期或不同組織間存在的各種微生物［1］。雖然進入植物體內的方法和時間不盡相同，但其一旦定植于植物體內的便可以與植物形成穩定地共生關系［2-3］。大部分植物體內均有植物內生菌存在，雖然其定植于植物體內的方式不盡相同，但是其在植物體內對寄主植物都具有多種作用，一些具有生防作用的有益內生細菌不僅能夠起到與化學農藥相似的作用，還能減少農藥濫用對環境和人類健康的危害，在植物保護方面有很大的應用價值［4］。植物內生菌的研究與生物肥料及相關菌劑制造息息相關，通過生物肥料和菌劑改善土壤條件有利于農業生產可持續發展，并可改善長期施用化肥而帶來的土壤酸化、重金屬污染等負面影響。因此，了解百香果內生菌的種群特點和系統發育關系，并對其內生菌的生物學功能與促生特性進行研究，挖掘菌種資源，從而將其應用于農業生產，對農業可持續發展做出貢獻。

百香果（Passiflora edulia Sims）屬于西番蓮科西番蓮屬，主要生長于熱帶和亞熱帶地區，常見品種有黃金、滿天星等。在種植1到2年后開始結果，花期較長一年多季，可種植10年左右。百香果具有食用、藥用和觀賞等多種經濟價值。果瓤內含大量汁液，加入糖和其他添加劑，可制成芳香可口的飲料，現多用于添加在各種飲品中以提供酸甜爽口的味覺體驗和富含維生素C與多種微量元素的營養價值。百香果花的花瓣多且柱頭有3個分裂水平分開，顏色多為白色和紫色，作為藤本植物可種植于庭園中以作觀賞，具有很大的市場潛力。我們從百香果根莖葉中分離純化內生細菌，并對其進行系統發育分析，之后進行生理生化試驗和相關功能性試驗以期望找到對植物生長具有促生作用，可在農業生產領域應用且具有多種促生特性于一體的微生物種質資源，從而更好地服務于農業生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 百香果（Passiflora edulia Sims）取自華南農業大學農場，選用百香果的根、莖、葉作為分離內生細菌的主要部位。

1.1.2 主要培養基 使用NFB無氮培養基［5］、DN無氮培養基［6］和LB培養基對百香果內生菌株分離純化。PKO培養基、鉀細菌篩選培養基和MSA-CAS培養基等［6］進行促生試驗。

1.1.3 主要試劑和儀器 氣象色譜儀，北京北分天普儀器技術有限公司；分光光度計，PCR儀、凝膠成像系統，Bio-Rad公司；3-吲哚乙酸，合肥博美生物公司；2×Taq PCR Mix、DNA Marker，北京擎科生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 參考譚志遠等［7］的方法。將采集到的健康百香果植株用清水洗去表面灰塵和泥土，根、莖取2-3 cm左右的小段若干，葉取3 cm×3 cm左右的葉片若干放入滅過菌的培養皿內置于超凈臺中進行表面滅菌，先用75%的酒精浸泡植物組織塊2-3 min，期間可用滅菌鑷子晃動組織塊使表面滅菌更充分，重復兩次，之后用無菌水洗滌2-3 min，重復兩次，將組織塊用4%次氯酸鈉浸泡4-7 min（根、莖浸泡時間偏長，葉浸泡時間偏短），之后再次用無菌水洗滌2-3 min，重復3次，保留最后一次洗滌的無菌水涂布在LB平板上作為對照，以確定植物組織塊外表面是否消毒徹底。將表面消毒完成的根、莖用滅菌的剪刀剪去兩端各約0.5 cm，保留1-2 cm的中間部分，同樣對葉片組織周圍減去約0.5 cm寬的葉片，保留2 cm×2 cm的中間部分，目的是將根、莖兩端及葉片周圍過度消毒的部分去除。之后將組織塊放入滅好菌的研缽中，加入無菌水，用研磨棒充分研磨，吸取0.1 mL研磨液于1.5 mL EP管中，加入0.9 mL無菌水充分混勻，然后將其濃度梯度稀釋為10-3、10-4、10-5，分別取50 μL稀釋液用涂布平板法涂布于NFB、LB、DN固體培養基上，倒置裝袋置于37℃恒溫培養箱培養，24 h后觀察培養基中菌落的生長情況，挑取生長狀況良好的單菌落以平板劃線法培養多代，直至獲得表型特征一致的純化菌株。

1.2.2 IS-PCR插入序列指紋圖譜聚類 以各菌株的全基因組DNA為模板，通過指紋圖譜（IS-PCR）方法［8］，使用通用引物J3進行PCR擴增，PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，50 μmol/L J3 1.0 μL，模板 DNA（40 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應條件為 ：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃50 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 5 min。參照劉麗輝等［6］的方法。之后使用GIS與TREECONW軟件對所得電泳圖譜進行聚類［9］。

1.2.3 16S rRNA基因系統發育學分析 16S rRNA基因擴增使用通用引物27F 和1492R。PCR反應體系 為（25.0 μL）：ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，DNA 模板（40 ng/μL）1 μL，PCR 反應程序：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 50 s，32 個循環 ；72℃ 5 min。由廣州天一輝遠公司對擴增產物測序。在NCBI數據庫中對所得序列進行16S rRNA BLASTN比對，將同源性最高的模式菌株與代表菌株用MEGA X軟件進行多序列比對，用Neighbor Joining法構建系統發育樹。

1.2.4 百香果內生菌生理生化鑒定 革蘭氏染色、甲基紅測定、產氨實驗、乙酰甲基甲醇實驗、脲酶測定、明膠液化測定、H2O2酶測定、NO3-還原實驗等均參照《微生物學實驗教程》［10］進行。

1.2.5 菌株固氮酶活測定及nifH基因擴增與分析 固氮能力的測定：將各類群代表菌株分別置于LB液體培養基中，置于37℃恒溫搖床中，120 r/min培養24 h，用無菌水稀釋成OD600為1的菌液，取10 μL接種于有3 mL半固體DN培養基的10 mL試管中，用經H2O2滅菌的膠塞密封，并用封口膜封住膠塞與試管連接處，置于37℃恒溫箱培養24 h，確定菌株定植于試管中后，用乙炔還原法（ARA）對其進行固氮酶活性測定，先抽取剩余空氣1/100體積的試管內氣體，之后向試管中注入等體積的100%乙炔氣體以確保氣壓一致。在37℃恒溫箱培養48 h后，用1 mL注射器從試管中抽取0.5 mL氣體注入氣相色譜，用氣相色譜儀測定乙烯與乙炔峰面積，進行3次重復，取平均值。

nifH基因的擴增參照Zehr等［11］的方法，引物使 用 Zehr-F（5′-TGYGAYCCNAARGCNGA-3′） 和Zehr-R（5′-NDGCCATCATYTCNCC-3′）（D：A，G 或 T；N：A，C，G或 T；Y：C或 T；R：A或 G）。PCR反應程序 ：97℃ 3 min ；97℃ 60 s，55℃ 50 s，72℃35 s，32個循環；72℃ 5 min。擴增后的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.6 菌株的促生特性 溶磷試驗：將菌株活化后用過滅菌的牙簽點種到PKO培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養2-5 d，通過觀察菌落周圍是否形成透明圈，判斷菌株是否具有溶磷能力，有透明圈則說明菌株具有溶磷能力。采用鉬銻抗比色法對各菌株溶磷能力大小進行測量［12］。

解鉀試驗：將菌株活化后用過滅菌的牙簽點種到鉀細菌固體培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養2-5 d，通過觀察菌落周圍是否有透明圈，判斷菌株是否具有解鉀能力，有透明圈則說明菌株具有解鉀能力。采用四苯和硼酸鈉法對各菌株溶磷能力大小進行測量［13］。

分泌生長素試驗：定性分析：將菌株活化后接種至King液體培養試管中，每個菌株設3個重復，置于搖床中28℃、120 r/min培養2 d。吸取50 μL菌懸液于陶瓷比色板上，加入等量比色液，設陰性對照和陽性對照，陰性對照加入50 μL未接菌的King液體培養基，陽性對照中加入50 μL濃度為10 mg/L的植物生長激素（IAA），之后在黑暗條件下靜置半個小時，觀察顏色變化，能產生生長素的菌株其混合液在靜置后會變為粉紅或紅色；定量分析：使用純的3-吲哚乙酸（3-IAA）制作標準曲線，采用Salkowski比色法［6］，對代表菌株分泌生長素的能力進行測定。

產鐵載體試驗：將菌株接種于MSA-CAS液體培養基中，置于37℃恒溫搖床，120 r/min培養3-5 d，觀察培養基變色情況，未變色則菌株不具有產鐵載體能力，如果培養基顏色變為粉紅色則菌株具有分泌鐵載體的能力。

產蛋白酶實驗：用脫脂奶粉瓊脂固體培養基對菌株進行產蛋白酶能力測定。A組分：Skimmed milk powder 35.0 g，500 mL H2O，B組分：Agar 20.0 g，500 mL H2O，A與B組分在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌30 min，A與B組分分開滅菌以防止結塊，滅菌完成后待其溫度降至60℃左右時快速混勻后制備產蛋白酶檢測平板。用滅過菌的牙簽將菌株點種在培養基中央，置于37℃恒溫培養箱中培養5 d后，觀察菌落周圍是否有透明圈形成，有透明圈出現則說明菌株具有產蛋白酶能力，通過計算透明圈直徑與菌落直徑的比值確定菌株產蛋白酶能力大小。

2 結果

2.1 百香果內生細菌的分離和純化

經分離純化后共得到51株百香果內生細菌。具體結果如表1所列。51株內生菌是從不同組織中分離得到的，其中根中分離到31株，莖中分離到13株，葉中分離到7株。

表1 百香果內生細菌菌株統計表Table 1 Strains isolated from P. edulia Sims

2.2 分離菌株IS-PCR指紋圖譜聚類分析

根據IS-PCR指紋圖譜的結果（圖1），使用TREECONW軟件將51株細菌聚為12類（圖2）。不同類群菌株指紋圖譜的條帶位置及數量之間存在明顯區別，顯示出各類群之間分子水平上的差異。

圖1 百香果51株內生菌IS-PCR指紋圖譜電泳圖Fig.1 IS-PCR fingerprinting patterns of 51 endophytes in P. edulia Sims

圖2 百香果51株內生菌的IS-PCR指紋圖譜聚類（UPGMA）Fig.2 Dendrogram of IS-PCR fingerprinting patterns（UPGMA method）of 51 endophytes in P. edulia Sims

2.3 菌株16S rRNA基因序列分析

對12個類群的代表菌株進行16S rRNA基因序列測定，測定結果在NCBI數據庫中用BLASTN進行相似度比對，結果見表2，使用MEGA X將相似性最高的模式菌株與代表菌株的基因序列用鄰接法進行聚類分析并構建系統發育樹（圖3）。

圖3 各類群代表菌株16S rRNA基因序列系統發育樹（鄰接法）Fig.3 Phylogenetic dendrogram of 16S rRNA gene sequences for representative strains（Neighbor-joining method）

表2 百香果各類群代表菌株16S rRNA基因序列相似性比對結果Table 2 Comparison results of 16S rRNA gene sequence similarity of representative strains of various groups of P. edulia Sims

2.4 代表菌株生理生化鑒定

通過對各類群代表菌株所做的生理生化試驗得到結果如下（表3）。具有固氮酶活性的代表菌株有 BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71、BXG53，其中BXJ71具有最高的固氮酶活性，達到447.93 nmol C2H4/（mL·h）。固氮酶nifH基因電泳圖見圖4，可見菌株BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71和BXG53在約360 bp處擴增出的nifH基因條帶。

圖4 代表菌株nifH基因PCR擴增產物電泳圖Fig.4 PCR products of the nifH gene in representative strains

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2.5 代表菌株的促生長特性

對各類群代表菌株進行可溶性磷定量測定，可溶性鉀定量測定，產蛋白酶定性試驗，產鐵載體能力試驗，產生長素定量試驗，結果見表4。菌株 BXG111、BXY92、BXG212、BXG101、BXJ71、BXG53具有溶磷能力，菌株BXG129、BXY92、BXJ201、BXG81、BXG212、BXJ71、BXG53 具有解鉀能力，菌株 BXG95、BXG129、BXG92、BXY92、BXG81、BXG212、BXG101、BXG201、BXJ71、BXG53具有產生長素能力，菌株BXG81、BXJ71、BXG53具有產鐵載體能力，菌株BXG95、BXG129、BXY92、BXG201、BXJ71具有產蛋白酶能力。其中BXJ71具有各試驗測試的促生能力，BXG53、BXY92和BXG212也具有多種促生能力（圖5）。

圖5 部分代表菌株促生特性Fig.5 Growth-promoting characteristics of some representative strains

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3 討論

本研究以百香果為材料從中分離純化出了51株菌株。這51株內生菌系統發育分析聚類為12類，10個屬12個種，分離部位是從百香果植株不同部位獲得的，體現了百香果內生菌的遺傳多樣性，同時具有多種促生長特性，內生菌的固氮酶活性隨分離部位及其種屬不同而顯示出一定的差異，分布在21.11-477.93 nmol C2H2/（mL·h）之間。Farhana等［14］對小麥內生菌進行分離純化，得到了7個屬15種不同的內生菌，對其進行了植物促生和促進植物抗逆性的試驗，得出小麥內生菌可通過分泌大量有益的促生代謝物促進植物生長并幫助寄主植物在逆境下生存；Bram等［15］對楊樹根際細菌和植株內生菌群落的結構變異及生態位分化的研究表明，楊樹內生菌在屬及以上的OUT水平顯示，根中以Rhizobiales、Rhizobium屬為主，莖中主要以Pseudomonas、Methylobacterium、Deinococcus屬為主，葉中以Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium屬為主，同時證明了田間生長的楊樹內生微生物組的結構變異性遠高于根際微生物組，這種更高的變異性可能與植物不同組織部位的生理環境差異和植物因外界環境變化而導致的體內營養物質、水分、激素等的變化有關。本研究的百香果屬于藤本植物，我們從其中分離得到了10屬12個種的內生菌，證明百香果內生菌具有豐富的遺傳多樣性，上述研究表明在草本和木本植物中也都有豐富的內生菌存在，這些不同種屬的內生菌有著多樣的生物學功能，可通過自身代謝和生長對植物產生促生及抗逆境脅迫等多種影響，對微生物多樣性研究和具有特異性功能菌株的開發有著重要的意義，同時更高的變異性也意味著植物內生菌對拓展微生物種質資源和研究不同微生物群落間相互作用有著極高的價值。進一步可將百香果功能菌株回接作物進行盆栽實驗和大田實驗，研究功能菌株對作物促生、抗病等功能的效果，進而使其能服務于農業，為農業生產做出貢獻。

本文分離純化得到的Ⅰ類群Bacillus altitudinis細菌最早是從收集高海拔空氣樣品的低溫管中分離得到的［16］，與類群Ⅱ的Bacillus circulans位于同一個屬，其都有產生長素的能力且在12個類群中最強，說明它們在促進植物生長發育方面優勢更加明顯，且類群Ⅰ的代表菌株BXG95產蛋白酶能力在12個類群中最強，而類群Ⅱ的BXG129又具有解鉀能力。Baliyan等［17］在對可促進鷹嘴豆生長的菌株研究中發現，從鷹嘴豆根際土壤分離出的MRN16同Bacillus altitudinis有99%的相似性，而此菌株在最優環境下的產生長素能力在2 d時約為30-40 mg/L，同本研究得出的24.32 mg/L較為接近，本試驗結果偏低的原因可能為菌株生長環境并非為最優導致的，同時MRN16菌株對鷹嘴豆種子發芽的促進作用明顯，我們推斷類群Ⅰ的代表菌株BXG95也具有良好的促生作用。

類群Ⅴ的Paenibacillus illinoisensis細菌是由F. E.Clark［18］從土壤中發現的，Paenibacillus屬和Bacillus屬最早在分類學上同屬于一個屬，后來于1993年由Ash等［19］提議將部分菌劃分為Paenibacillus屬。本試驗類群Ⅴ代表菌株BXY92具有溶磷、解鉀、產生長素和產蛋白酶多種能力，且解鉀和產蛋白酶能力較強。Liu等［20］對Paenibacillus illinoisensis細菌促進花生生長的能力進行了田間試驗，結果表明接種Paenibacillus illinoisensis細菌的植株莢果產量比對照提高了37.05%，對植株全氮、磷、鉀的積累具有促進作用，這同本研究對類群Ⅴ代表菌株BXY92進行的促生特性試驗結果相符合。

類群Ⅶ的Rhizobium pusense細菌是由Digvijay等［21］于2011年從鷹嘴豆的根際分離并命名的，其屬于根瘤菌屬，雖然大眾會有根瘤菌是同豆科植物根莖共生的印象，但是其共生特性在遺傳上是不穩定的，這增加了非共生根瘤菌在其他植物根莖、土壤中發現的可能性，因此一些從其他植物根莖、土壤中發現根瘤菌的現象有被報道，Soberon-Chavez，Quigley等［22-23］在土壤中發現過根瘤菌，Segovia，Yanni和Mónica等［24-26］在根際土壤和其他植物根莖中發現過根瘤菌。本試驗類群Ⅶ的代表菌株BXG81分離部位是百香果植株的根系，這也驗證了根瘤菌可在豆科植物根瘤以外的植物組織存在，其具有生物固氮、解鉀、產生長素和分泌鐵載體能力，微生物通過合成分泌自身生存需要的鐵載體使其能在低鐵環境中螯合環境或宿主細胞中的鐵，為其生長提供了鐵元素，有研究表明具有產鐵載體能力的細菌可以降低土壤重金屬含量［27］，還對植物具有促生能力［28］，并能增強植物抵抗病原菌的能力［29］。

類群Ⅷ的Beijerinckia fluminensis細菌最早是從巴西不同地區收集的土壤樣品中分離得到的［30］。本試驗類群Ⅷ的代表菌株BXG212具有生物固氮、溶磷、解鉀和產生長素的能力。Krupali等［31］對多種藥用植物進行內生菌分離和純化后得到了5株具有促生作用的菌株，其中從姜黃根莖中分離出的C-1菌株經鑒定為Beijerinckia fluminensis細菌，促生功能試驗結果同本研究結果一致，同時其對C-1菌株也擴增出了nifH基因，再次從基因層面證明了其具有生物固氮的功能。

類群Ⅺ的Klebsiella michiganensis細菌最初報道是從美國密歇根州一個家庭的牙刷架上分離得到的，后來也有從植物組織中分離出來的報道［32］，與類群Ⅻ的Klebsiella pneumoniae細菌同屬Klebsiella屬，K.pneumoniae有從多種植物中分離出的報道［33-35］。付思遠等［36］對泓森槐內生固氮菌的分離中得到了和K. michiganensis細菌相似度為100%的菌株，其分離部位是植株的莖稈部分，具有固氮酶活性和多種促生作用，本實驗類群Ⅺ也主要由莖中分離同樣具有固氮酶活性且所具有的促生作用相似，而本試驗類群Ⅺ中有一株菌為根系中分離，可能表明K.michiganensis細菌主要分布于植物莖中但也有少數情況可在植物根系中定植。龔鳳娟等［37］對杜仲內生細菌進行分離得到了5株內生細菌，其中分離出了和K. pneumoniae細菌相似度為99%的菌株，其具有ACC脫氨酶活性和抑菌作用，具有ACC脫氨酶活性的植物根際和內生細菌對提高植物抗逆境脅迫中有重要作用，而其抑菌作用可能與其具有分泌鐵載體能力有關。本試驗這兩個類群的代表菌株BXJ71和BXG53都具有生物固氮、溶磷、解鉀、產生長素和分泌鐵載體的能力，BXJ71又具有產蛋白酶能力且生物固氮能力在12個類群中最強，說明其對植物氮素的提供上有較強的促進作用，而BXG53的溶磷和解鉀能力在12個類群中最強，說明其對植物磷、鉀元素的提供上有較強的促進作用。

4 結論

本研究分離得到百香果內生菌51株分屬于12個類群，為10個屬的12個種，其中從根中分離得到31株，莖中分離得到13株，葉中分離得到7株，通過各促生特性試驗結果表明從百香果中分離得到的內生菌不但具有種群多樣性，而且具有功能多樣性，百香果內生菌除了具有溶磷、解鉀、分泌生長素功能，還有具有生物固氮和產鐵載體等促生功能于一體的菌株，其中菌株K. michiganensis BXJ71有最高的固氮酶活性，與K. pneumonia BXG53、Beijerinckia fluminensis BXG212在各方面的促生能力都很強，是集多種功能于一體的微生物種質資源，在農業生產方面具有廣闊的應用前景。