磷水平與叢枝菌根真菌對桔梗生長及品質的影響

李楠海 孫卓 楊利民

（吉林農業大學中藥材學院，長春 130118）

桔 梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］為桔梗科多年生草本植物，其根及根莖入藥［1］，性苦、辛，平，歸肺經，有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效［2］。叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌作為一種綠色有效的生物肥料廣泛應用于作物栽培領域，然而土壤磷水平會在某種程度上制約菌根共生體的生長［3］，高磷或低磷均不利于AM真菌侵染宿主植物，甚至會抑制宿主植物生長［4］。對于藥食同源的桔梗而言，如何提高桔梗產量的同時提高其藥用成分含量一直是重要的研究課題。近年來，AM真菌對植物的促生效應越來越受到重視，但關于AM真菌與桔梗共生效應的研究較少，不同土壤磷水平下AM真菌與桔梗的共生關系尚不明確。因此，本研究通過對盆栽桔梗試驗，分析不同土壤磷水平條件下不同AM真菌對桔梗產量及質量的影響，確定AM真菌和磷水平的最佳組合，為科學使用AM真菌提高桔梗品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試桔梗種子采收自吉林農業大學藥用植物園，經吉林農業大學楊利民教授鑒定為桔梗科植物桔梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］的種子。供試AM真菌菌種：摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，FM）、 根 內 根 孢 囊 霉（Rhizophagus intraradices，RI）和象牙白多樣孢囊霉（Diversispora eburnea，DE）均購于北京市農林科學院植物資源與營養研究所（BGC編號和國家微生物資源平臺編號分別為BGC BJ01，1511C0001BGCAM0010；BGC BJ09，1511C0001BGCAM0042；BGC XJ06B），接種劑為經三葉草和高粱擴繁后獲得的含有孢子、菌絲、侵染根段的沙子、沸石混合物，測定各菌劑接種勢［5］分 別 為 913.68（IP/g）、1 994.21（IP/g）、1 251.61（IP/g）。供試肥料為磷酸二氫鈉。供試土壤pH值6.76；速效磷20.75 mg/kg，堿解氮23.80 mg/kg；速效鉀222.81 mg/kg；有機質含量2.71%。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 本試驗在吉林農業大學溫室中進行。共設 4個磷水平，P0（20 mg/kg）、P1（50 mg/kg）、P2（80 mg/kg）、P3（140 mg/kg）；同一磷水平4個處理，接種摩西斗管囊霉（FM）、根內根孢囊霉（RI）、象牙白多樣孢囊霉（DE）及不接種處理（CK）。試驗盆隨機排列，2019年將桔梗種子直播于塑料盆中，每盆裝土5 kg，FM、RI、DE處理組分別層施接種劑100 g、47 g、73 g，接種勢約為91 368（IP/g），不足100 g的菌劑加入滅菌菌劑補足。CK處理組加入相同質量的滅菌菌劑以保持微生物區系一致。生長期間，常規管理，于2020年收獲。

桔梗樣品取回后用清水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分。選取細嫩，堅韌的根，剪成1 cm左右的根段，放入FAA固定液中固定，用于菌根侵染率率的測定；將桔梗葉片組織分裝于凍存管，液氮冷凍貯存于-80℃冰箱，用于保護酶活性、滲透調節物質及丙二醛含量的測定，稱取桔梗根鮮重，使用游標卡尺量取桔梗株高、莖粗、根粗等指標并記錄。將桔梗根置于烘箱中低溫烘干至恒重后，測定桔梗樣品根干重，將樣品粉碎后保存，用于桔梗皂苷測定。

1.2.2 侵染率測定 菌根侵染率測定參考Vierheilig等［6］方法：從固定液中取出根段，用水沖洗干凈，放入試管中，加入10% KOH浸沒根段，在水浴90℃煮1 h，然后倒出KOH，并以清水洗凈。再向試管中加入墨水醋染色劑，煮開10 min，倒出染色劑，并以清水清洗干凈，制片觀察。

1.2.3 保護酶及滲透調節物質測定 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.2.4 桔梗皂苷測定 桔梗皂苷采用超聲波提取法，測定參考岳虹等［7］方法：稱取桔梗粉末2 g，準確加入80%甲醇30 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，離心并過濾，重復3次，合并濾液，最后定容至2 mL容量瓶備用。提取液過0.22 μL微孔濾膜，采用HPLC-ELSD法測定桔梗根中桔梗皂苷含量，色譜柱：C18分析柱（250 mm×4.6 mm），DAD檢測器，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；ELSD檢測器，漂移管溫度為75℃，霧化管溫度75℃，載氣（N2）流量為2.5 L/min；進樣量：12 μL，流動相：乙腈（A）和0.2%甲酸（B）。以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，根據標準曲線方程，計算各桔梗皂苷含量。

1.2.5 桔梗總皂苷測定 桔梗總皂苷測定采用香草醛—硫酸比色法，參考張堅等［8］方法：精確稱取3.8 mg桔梗皂苷D置10 mL容量瓶中，甲醇定容得對照品溶液。稱取對照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置10 mL具塞試管中，水浴干燥后加入10%香草醛試液0.5 mL，60%硫酸4.5 mL，于60℃水浴加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，以不加皂苷的樣品為空白對照，檢測波長470 nm，得回歸方程Y =0.0007X-0.0263，R2=0.999 6，計算桔梗總皂苷含量。

1.2.6 數據分析 采用Microsoft Excel 2010進行數據處理分析與整理，以 SPSS 20.0 和 DPS 19.0 進行數據統計分析，采用Orign 2018 64bit軟件制圖。

2 結果

2.1 不同磷水平AM真菌對桔梗侵染效果分析

2.1.1 不同磷水平AM真菌對桔梗侵染率、侵染強度的探究 從圖1中可以看出，在同一磷水平時，接種FM、RI和DE的處理侵染率均顯著高于未接種處理（P＜0.05）。土著菌對未接種植株也具有一定侵染率，且各處理侵染率均隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達到最大值（RI除外），分別為57.7%、38.3%、41.7%。侵染強度的變化與侵染率的變化大體趨勢一致，在同一磷水平，接種3種AM真菌的處理侵染強度均顯著高于未接種處理（P＜0.05），隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達到最大值，3種處理侵染強度分別為50%、30%、25%。在同一水平下，接種FM真菌的處理侵染率和侵染強度均高于RI和DE處理，說明FM與植物的親和力大于RI和DE。由此可見適量的磷能促進菌根的侵染，而過量磷反而抑制其侵染。

圖1 AM真菌和磷水平對桔梗侵染率、侵染強度的影響Fig.1 Effects of AMF and phosphorus level on the infection rate and infection intensity of P. grandiflorum

2.1.2 不同磷水平土壤中AM真菌的孢子量的探究 由圖2可知，未接種處理中也發現了真菌孢子，應該為土壤中土著菌產生。在同一磷水平下接種FM處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05），無論在何種磷水平時，接種3種AM真菌的處理土壤AM真菌孢子數均顯著高于未接種處理（P＜0.05）。接種處理與未接種處理的土壤AM真菌孢子數隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達到最大值，分別為215個/克土、205個/克土、133個/克土。

圖2 AM真菌和磷水平對土壤AM真菌孢子數的影響Fig. 2 Effects of AMF and phosphorus level on the spore number of AMF in soil

2.2 不同磷水平AM真菌對桔梗生物量的影響

由表1可知，接種FM、RI和DE后，桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長均有不同程度的提高，且隨著磷水平的升高呈現出先升高后下降的趨勢，在P2水平時達到最大值。在P2水平下，與未接種對照相比，桔梗株高差異不顯著；桔梗根干重分別增加43%、31%、7%；桔梗根鮮重分別增加114%、62%、90%；桔梗根粗分別增加26%、25%、24%。雙因素方差分析結果（表2）表明，磷水平對桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長有顯著影響（P＜0.05）；AM真菌對桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長有顯著影響（P＜0.05）；且二者對桔梗株高、根干重、根鮮重有顯著交互作用（P＜0.05）。

表1 AM真菌和施磷量對桔梗生物量的影響Table 1 Effects of AMF and phosphorus application rate on P. grandiflorum biomass

表2 磷水平和AM真菌對桔梗生長指標的雙因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on the growth indexes of P. grandiflorum

2.3 不同磷水平AM真菌對桔梗抗逆性的影響

2.3.1 不同磷水平AM真菌對桔梗保護酶活性的影響 根據圖3可知，接種AM真菌后的植株其SOD、POD活性較未接種植株有明顯提高（P＜0.05），隨著磷水平的升高，無論是接種植株還是未接種植株其SOD活性均呈現出先升高后降低的趨勢，且在P2水平時達到最大值分別為720.25 U/g、655.78 U/g、623.88 U/g，較CK組分別提高了25%、14%、8%。在同一磷水平下，3種接種AM真菌處理的POD活性大小分別為，FM＞RI＞DE，且在P2水平達到最大值分別為156 U/g、150.67 U/g、136 U/g，較CK組分別提高了25%、21%、9%。

圖3 不同處理桔梗葉中保護酶活性變化Fig. 3 Variations of protective enzyme activities in P.grandiflorum leaves under different treatments

2.3.2 不同磷水平AM真菌對桔梗滲透調節物質和丙二醛含量的影響 由圖4可知，在同一磷水平下，接種FM、RI和DE后，其可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于未接種植株（P＜0.05）。隨著磷水平的不斷升高，可溶性糖和可溶性蛋白均呈現出先上升后下降的趨勢，且在P2水平時達到最大值。在P2水平時，與未接種處理相比，可溶性糖分別提高71%、70%、38%；可溶性蛋白分別提高75%、52%、16%。根據圖4可知，在同一磷水平下，接種AM真菌后的植株二者含量均顯著低于未接種植株（P＜0.05），說明接種AM真菌可在一定程度上降低脯氨酸和丙二醛含量，從而緩解植株遭受的環境脅迫，增強植株抗逆性。

圖4 不同處理桔梗葉中滲透調節物質及丙二醛含量變化Fig. 4 Changes of osmotic adjustment substance and malondialdehyde content in P.grandiflorum leave under different treatments

雙因素方差分析結果（表3）表明，磷水平和AM真菌均對桔梗葉片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有顯著影響（P＜0.05）；且二者對桔梗桔梗葉片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有顯著交互作用（P＜0.05）。

表3 磷水平和AM真菌對桔梗抗性指標的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on resistance index of P.grandiflorum

2.4 不同磷水平AM真菌對桔梗皂苷積累的影響

由圖5可知，在同一磷水平下，接種后的植株桔梗皂苷含量均顯著高于未接種植株（P＜0.05）。接種FM、RI和DE后，桔梗皂苷含量隨著磷水平的升高呈現先升高后下降的趨勢，且在P2水平達到最大值。在P2水平下，與未接種對照相比，桔梗皂苷D含量分別增加20%、18%、16%；桔梗皂苷D3含量分別增加29%、11%、22%；去芹糖桔梗皂苷D含量分別增加22%、5%、8%；去芹糖桔梗皂苷D3含量分別增加21%、11%、17%；總皂苷含量分別增加19%、7%、11%。

圖5 各處理間桔梗皂苷含量變化Fig. 5 Variations of platycodin content in different treatments

雙因素方差分析結果（表4）表明，磷水平和AM真菌均對桔梗皂苷D、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、總皂苷有顯著影響（P＜0.05）；且二者對桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、總皂苷有顯著交互作用（P＜0.05），對桔梗皂苷D無顯著交互作用（P＞0.05）。

表4 磷水平和AM真菌對桔梗皂苷的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on platycodin

3 討論

AM真菌能否在植物根系成功定殖是其與植物共生的基礎，因此侵染率成為衡量植物根系與真菌共生情況的一個重要指標［9］。本研究表明，土著AM真菌對桔梗也存在一定程度的侵染，其侵染率最高可達21.3%。接種AM真菌后，在P2水平時，菌根侵染率、侵染強度、孢子數比P0水平時顯著增加，當達到P3水平時菌根侵染率降低，由此表明，適宜磷水平可以促進AM真菌侵染植物根系，過高或過低磷水平均不利于AM真菌侵染。研究證實，當土壤速效磷含量較高時，植物體內的磷含量也會變高，使得其根部細胞膜的滲透性降低，導致根系分泌物減少，而這會使AM真菌大大減少與根系形成二次侵入的機會，進而降低了AM真菌侵染率［10］，當土壤速效磷含量較低時，一方面桔梗生長發育需要磷，另一方面AM真菌的生長發育也需要一部分磷。當土壤磷含量無法同時滿足兩方面的需求時，AM真

菌的生長就受到一定水平的抑制，導致其侵染率較低。此外，在同一磷水平時，FM侵染率、侵染強度、孢子數均高于另外兩個菌種，表明其在栽培桔梗中比另外兩個菌種更具應用潛力。因此要將AM真菌的接種效應發揮到最大化，應該篩選適合宿主植物的AM真菌種類，并確定其最適磷水平，以確保菌根共生體生長狀況達到最優，更大程度地提高AM真菌的促生作用。

植物在遭受某些逆境脅迫時，會使SOD、POD等保護酶的活性大幅升高，迅速清除活性氧［11］。本研究表明，在P0和P3水平時，接種植株SOD、POD活性顯著高于未接種植株，說明植物在低磷和高磷條件時，會增加體內保護酶來抵抗不良環境的影響，而接種AM真菌可以提高保護酶的活性，保護植物免受傷害，這與楊國等［12］研究結果一致。此外，在同一磷水平下，FM、DE及RI三種菌種均可提高SOD、POD活性，且FM提升效果優于DE和RI。在適宜磷水平時，接種AM真菌后能顯著提高桔梗SOD、POD活性，說明接種AM真菌可以提高桔梗抵抗逆境的能力，這可能是AM真菌提高桔梗活性氧清除能力，加快清除氧自由基的結果。此外，植物還可通過滲透調節來增強自身抗逆性［13］。本研究發現，P0和P3水平時，接種與未接種植株可溶性糖、可溶性蛋白含量降低，而脯氨酸和丙二醛含量升高，這與滕華容等［14］研究結果相似。接種AM真菌后，桔梗植株可溶性糖、可溶性蛋白的含量顯著高于未接種植株，脯氨酸含量顯著低于未接種植株，說明接種AM真菌通過增強植物對水分的吸收，緩解植物受到不良環境的脅迫，進而增強植物抗逆性，與趙金莉等［15］研究結果一致，AM真菌可以通過調控植物體內滲透調節物質，進而幫助機體抵御逆境，增強其環境適應性。本試驗結果認為FM比RI和DE更有利于桔梗可溶性蛋白和可溶性糖的提高，但齊國輝等［16］認為RI比FM更有利于植株可溶性蛋白的形成，這可能是因為AM真菌對宿主植物某些指標的促進作用并不只受菌種的影響，還與宿主植物的種類、管理條件、培養基質等條件有關。

在不同土壤磷水平下，接種 AM 真菌能緩解磷限制并促進幼苗生長［17］。本研究結果表明，接種同一菌種后，P1、P2、P3水平的根鮮重顯著高于P0水平，且P2水平時達到最高。在同一磷水平接種3種AM真菌后的根鮮重顯著高于未接種桔梗，3種AM真菌的根鮮重差異不顯著。說明在適宜磷水平接種AM真菌可以促進桔梗生長提高其生物量。AM真菌可通過與植物共生引起的代謝變化來影響藥用植物有效成分含量［18］。本研究發現，接種FM后的植株桔梗皂苷含量顯著高于接種RI、DE及未接種植株，說明FM菌種較RI和DE菌種更具優勢。有學者認為［19］，植物次生代謝產物是植物面對外界環境刺激時做出的防御性反應。接種AM真菌后桔梗皂苷含量顯著提升，推測可能是桔梗將AM真菌作為外界環境的刺激而產生的系統防御應答，這與前人的研究結果一致［20］。同時，各處理在P2水平下，桔梗皂苷含量達到最高，說明磷水平過高或過低都會影響桔梗皂苷含量。磷水平過低，不能滿足桔梗和AM真菌的生長需求，使菌根共生體生長受到極大限制；當磷水平過高時，桔梗自身吸收的養分足以維持自身各種代謝，AM真菌的效果就不顯著［21］，另一方面過高的磷水平使AM真菌的生長和代謝活性下降，導致菌根共生體吸收養分受到一定的限制［19］，進而使桔梗皂苷合成受阻。適宜磷水平接種AM真菌可以誘導桔梗次生代謝過程的變化，更有利于桔梗皂苷的積累。

4 結論

FM、RI和DE均可與桔梗共生，不同磷水平接種不同AM真菌在促進桔梗生長、增強桔梗抗逆性、提高桔梗皂苷積累等方面存在不同程度的差異，綜合分析在80 mg/kg磷水平時，接種AM真菌效果最好，且FM優于RI和DE。