常溫常壓等離子體誘變選育高產L-異亮氨酸大腸桿菌

李曉芳 劉慧燕 潘琳 艾治宇 李一鳴 張恒 方海田

（寧夏大學食品與葡萄酒學院 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，銀川 750021）

L-異亮氨酸是支鏈氨基酸之一，也是人體必需氨基酸，在食品、醫藥、化工和飼料領域有廣泛應用，而且它的需求量逐年增加［1］。目前L-異亮氨酸的生產方法主要是發酵法，增加L-異亮氨酸產量的方法主要通過代謝途徑進行精準調節，Shi 等［2］通過過表達ppc和lysC來增加L-異亮氨酸的前體物質產量從而提高L-異亮氨酸產量；Dong等［3］通過敲除ddh和 lysE解除蘇氨酸和L-異亮氨酸的反饋抑制來提高L-異亮氨酸的產量；還有研究通過控制當量生物素、分析代謝流上的關鍵酶及分子能量作用，來進一步提高L-異亮氨酸產量［4-6］。目前國內L-異亮氨酸的生產效率并不能滿足當前我國日益增長的需求，與日本等國家還有很大的差距，因此選育高產量的L-異亮氨酸生產菌是當前亟待解決的問題［7］。

常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種技術是一種微生物基因組高效快速誘變育種技術，該技術操作簡便、成本低、效率高、突變條件溫和，目前已被用于多種微生物的生物育種［8］，Cheng 等［9］利用 ARTP成功選育了高產L-精氨酸菌株；Qiang 等［10］利用ARTP成功選育高產番茄紅素菌株；Li 等［11］利用ARTP成功選育高產花生四烯酸菌株；Zhang 等［12］利用ARTP成功選育高產木糖醇酵母菌。傳統的微生物培養主要以搖瓶、多孔板、深孔板等容器為主，難于控制實驗操作的一致性，目前高通量篩選主要應用在藥物上［13］，而食品上應用的高通量篩選仍是傳統的多孔篩選［14］。MMC的微液滴培養體系能充分實現實驗操作的一致性，精準高效的控制實驗過程，是高通量篩選的新技術，目前應用非常少，幾乎沒有報導。在L-異亮氨酸的合成途徑中，蘇氨酸脫氫酶是L-異亮氨酸合成途徑中的關鍵酶，異亮氨酸對其有反饋抑制作用［15］，選育α-AB的抗性突變菌，可解除異亮氨酸對蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制作用，從而提高異亮氨酸的產量［16］，在得到大量突變菌體的基礎上，利用MMC實現高通量篩選。

本研究以大腸桿菌K12（Met-）作為出發菌株，采用ARTP誘變技術進行多輪誘變，以異亮氨酸的結構類似物α-AB作為抗性標記，使用MMC進行高通量液滴篩選，進行高通量適應性進化和發酵培養復篩，獲得一株高產L-異亮氨酸的誘變大腸桿菌突變菌株，對其遺傳穩定性進行驗證，并在搖瓶發酵條件下對L-異亮氨酸進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌株與試劑 大腸桿菌K12（Met-），寧夏大學食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室保藏。

無水乙醇、冰乙酸、乙腈、2，4 - 二硝基氟苯（均為分析純）。

1.1.2 培養基（g/L） （1）LB培養基：蛋白胨10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，瓊脂粉 15.0，pH7.0-7.2，121℃ 條件下滅菌15 min。（2）種子培養基：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH7.0-7.2，121℃條件下滅菌15 min。（3）發酵培養基：葡萄糖100.0，磷酸二氫鉀3.0，玉米漿20.0，碳酸鈣2.0，硫酸銨20.0，硫酸鎂 2.5，硫酸亞鐵 0.01，pH7.0-7.2，121℃ 條件下滅菌 15 min［17］。

1.1.3 相關溶液配制 L-異亮氨酸標準液、α-AB母液、NaCO3-NaHCO3緩沖液、10%乙酸溶液、苯酚紅溶液。

1.1.4 儀器與設備 ARTP常溫常壓等離子體誘變育種儀、全自動高通量微生物液滴培養儀：無錫源清天木生物科技有限公司；SBA生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；Easysep1010高效液相色譜儀：上海通微分析技術有限公司；AgilentC18（25 mm×4.6 mm，3.5 μm）：安捷倫科技有限公司；WFZ UV-2000紫外分光光度計：尤尼科儀器有限公司；生化恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；恒溫搖床：上海福瑪實驗設備；超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；LDZX-40滅菌鍋：上海三申。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及培養 將保存在 -80℃ 冰箱的大腸桿菌K12（Met-）劃線接種于LB培養基上，37℃倒置培養1 d；挑去平板上的單菌落接種到LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下過夜培養16 h，制成OD600值為0.6-0.8的菌懸液，加入10%甘油，放入超凈工作臺備用。

1.2.2 菌株ARTP誘變時間的確定 將ARTP的溫度保持在20℃，調節功率100 W，氦氣流量為10 L/min［18］。吸取10 μL菌懸液均勻涂在金屬載片上，將載片用鑷子放入誘變室內，采用不同的時間（0 s、30 s、60 s、90 s、150 s、180 s、240 s）對菌液進行誘變處理，誘變后的菌體在1 mL超純水中充分洗脫1 min后，取100 μL涂布于LB培養基平板上，37℃過夜培養［19］，根據計算的致死率，確定最佳誘變時間。

1.2.3 單因素多水平確定α-AB最高使用濃度 將配制好的1 mol/L的α-AB按要求裝入MMC 化學因子進樣瓶中，菌液進樣瓶裝好菌液，培養基進樣瓶裝好液體LB培養基。按照儀器操作流程進行操作，將化學因子進樣瓶中溶液設置8個濃度梯度分別為 0%、9.375%、19.5312%、29.6875%、39.8438%、50%、59.375%、100%，每個濃度梯度設置5個平行，共創建40個液滴。液滴培養24 h后，選擇最高適應濃度長得比較好的液滴進行液滴收集，將收集好的液滴用生理鹽水稀釋至10-2，將其分別涂布于抗性篩選平板上，37℃過夜培養，挑取比較圓而且大的單菌落接至液體培養基中，37℃、200 r/min過夜培養，備用。

1.2.4 突變菌株的適應性進化 將單因素多水平篩選培養好的菌液吸取600 μL于10 mL液體培養基中，裝入MMC 菌液進樣瓶中，化學因子進樣瓶裝入1 mol/L的α-AB，培養基進樣瓶裝好液體LB培養基，按照儀器操作流程進行操作，將化學因子進樣瓶中溶液設置8個濃度梯度分別為0%、2.778%、9.735%、16.667%、28.054、48.002%、58%、98.883%，每個濃度梯度3個平行，8 h傳一代，共創建48個液滴。液滴培養48 h后，收集在最高濃度梯度長勢較好的菌株經稀釋后涂布在抗性平板上，37℃過夜培養，挑取比較圓而且大的單菌落接至液體培養基中，37℃、200 r/min過夜培養，備用，并將該收集好的菌株送至上海生工測序。

1.2.5 高產L-異亮氨酸誘變菌株的發酵培養 將原始菌株和篩選得到的高產L-異亮氨酸的誘變菌株分別接于種子培養基中，37℃、200 r/min條件下培養16 h；按10%的接種量接種至發酵培養基中，37℃、200 r/min條件下培養48 h，利用高效液相色譜儀分別測定其L-異亮氨酸的產量。

1.2.6 高產L-異亮氨酸誘變株的遺傳穩定性 將誘變后的菌株活化后配制OD600值不超過1.0的菌懸液裝入MMC機器的菌液進樣瓶中，化學因子進樣瓶、培養基進樣瓶按照儀器操作要求只裝LB液體培養基，將適應性進化頁面的化學因子濃度梯度都設為0%，傳代時間設為8 h，連續傳10代觀察其生長狀況，分析生長曲線同時收集每一代長勢較好的液滴保存進行后續發酵實驗。

2 結果

2.1 ARTP最佳誘變時間的確定

致死率的選擇直接影響菌株的突變率，本實驗設置不同的誘變時間，計算誘變時間對大腸桿菌致死率的影響，實驗結果如圖1所示。從圖1中可以看出，當誘變時間為90 s時，菌株致死率達到86.92%；當誘變時間為150 s時，菌株致死率達到90.65%；當誘變時間為180 s時，菌株致死率達到98.13%；當誘變時間為240 s時，菌株致死率達到100%。因此選擇致死率在98%以上的180 s為最佳誘變時間。

圖1 大腸桿菌ARTP誘變致死率曲線Fig. 1 Lethality curve of Escherichia coli ARTP mutagenesis

2.2 α-AB最高使用濃度的確定

適應結構類似物濃度的確定可以初步判斷該菌株解除反饋抑制的能力。本實驗利用MMC對α-AB的使用濃度進行單因素多水平實驗，從圖2中可以看出，當α-AB的使用濃度在前兩個濃度時，所有液滴OD值在0.87左右，說明該濃度下菌體均能正常生長，隨著α-AB的使用濃度增大，第3個濃度的大部分OD值在0.46左右，極少數液滴OD值接近0.50，其余液滴OD值在0.40左右；當α-AB的使用濃度在第4個濃度時，只有極個別液滴的OD值達到0.50左右，其余液滴的OD值均為負值，這表明該濃度已經對菌株產生了毒害作用；第5個到第8個濃度，所有液滴的OD值均為負值，這說明該4個濃度條件下，菌株不能生長。因此，由實驗結果確定，α-AB的最高使用濃度為第4個濃度29.6875%。

圖2 大腸桿菌NXU12單因素多水平曲線Fig. 2 Single-factor multi-level curve of E. coli NXU12

2.3 突變菌株適應性進化結果

研究表明，在菌株可以正常生長的范圍內，α-AB使用濃度越高，L-異亮氨酸積累的量就越多，L-異亮氨酸解除自身濃度反饋效果越明顯，因此L-異亮氨酸產量會更高。本實驗利用誘變后的菌株，在確定其可適應的α-AB最高使用濃度基礎上，進一步進行適應性進化，實驗結果如圖3所示。在α-AB的使用濃度低于第5個濃度時，所有液滴OD值均在0.67左右，長勢基本一致，只有2號液滴OD值明顯增大接近于0.8；在α-AB的使用濃度接近第6個濃度時，大部分液滴OD值明顯減小均在0.12左右，只有2、3號液滴OD值明顯增大達到1.35、1.78，這說明2、3號液滴已經適應當前濃度并且長勢明顯變好；當α-AB的使用濃度大于第6個濃度時，所有液滴的OD值均無變化，說明此濃度對菌體本身產生毒害作用。實驗結果表明，該突變菌株經適應性進化后，α-AB的使用濃度為第6個濃度48.002%。

圖3 大腸桿菌NXU12適應性進化曲線Fig. 3 Adaptive evolution curve of E. coli NXU12

2.4 菌株測序結果

為驗證適應性進化所得到的菌株是否為突變株，將該菌株制成菌懸液送至上海生工進行測序，測序基因為 ilvA，測序結果利用軟件分析后如圖4所示。圖 4 中紅色箭頭為大腸桿菌 K12，綠色箭頭為大腸桿菌 NXU12，測序結果相同性為81.15%，從圖中可以看出，大腸桿菌 NXU12 發生了大量基因的突變，這可能是導致該菌株可以適應高濃度α-AB的原因。

圖4 大腸桿菌K12、NXU12測序結果Fig. 4 Sequencing results of E. coli K12 and NXU12

2.5 高產L-異亮氨酸菌株NXU12發酵結果

將原始菌株K12、誘變菌株NXU12進行搖瓶發酵培養，采用分批補料的發酵方法，發酵期間保持pH在7.0-7.2之間、期間補充60%的葡萄糖溶液以保證菌體能夠正常生長、補充尿素保證碳源充足。連續發酵40 h后，耗糖曲線如圖5所示，采用2，4 -二硝基氟苯法進行柱前衍生化處理，利用高效液相色譜儀（HPLC）檢測發酵液中L-異亮氨酸的濃度，結果如圖6所示。

圖5 大腸桿菌K12、NXU12耗糖量曲線Fig. 5 Sugar consumption curve of E. coli K12 and NXU12

從圖5可以看出，從發酵開始大腸桿菌NXU12的耗糖量略高于K12；在發酵中期兩株菌的耗糖量趨勢基本一致，這可能是NXU12發生突變后并沒有影響其自身生長；發酵后期K12的耗糖量基本穩定，而NXU12的耗糖量呈微量上升趨勢，這可能是因為NXU12突變，在發酵后期菌體仍然可以正常生長，正常消耗糖。

從圖6可以看出，NXU12發酵40 h后，L-異亮氨酸的濃度為17.468 2 g/L，比原始菌株提高了61.23%。NXU12在發酵中后期L-異亮氨酸積累量較高，這可能是因為NXU12可以適應高濃度的α-AB，在發酵過程中解除了L-異亮氨酸對蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制，從而使L-異亮氨酸不斷積累濃度提高。

圖6 大腸桿菌K12、NXU12 L-異亮氨酸濃度Fig. 6 E. coli K12 and NXU12 L-isoleucine concentration

2.6 大腸桿菌遺傳穩定性測定結果

將突變菌株大腸桿菌NXU12連續傳10代后，收集長勢比較好的液滴進行生長曲線和發酵液中L-異亮氨酸濃度測定。從圖7可以看出，傳10代后的大腸桿菌NXU12仍能正常生長，從圖8可以看出該突變菌株發酵液中L-異亮氨酸濃度穩定，這說明誘變菌株遺傳穩定性良好。

圖7 大腸桿菌NXU12傳10代后生長曲線Fig. 7 Growth curve of E. coli NXU12 after 10 generations

圖8 大腸桿菌NXU12傳10代L-異亮氨酸濃度Fig. 8 L-isoleucine concentration of E. coli NXU12 for 10 generations

3 討論

本實驗主要通過ARTP結合MMC生物誘變及高通量篩選體系，以α-AB為抗性標記定向選育L-異亮氨酸高產大腸桿菌，最終成功選育出一株可在α-AB濃度為 48.002% 即 49.44 g/L條件下正常生長的突變菌株大腸桿菌NXU12。該菌株搖瓶發酵 40 h后，L-異亮氨酸濃度為17.462 8 g/L，較原始菌株提高了60.23%，此外通過測定了發酵液中L-蘇氨酸的濃度發現，L-蘇氨酸的濃度明顯比原始菌株提高，這說明高濃度的α-AB可激活天冬氨激酶從而解除蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制增加L-異亮氨酸前體物質蘇氨酸的積累量。孔帥等［20］利用ARTP 成功選育高產L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌B1，該菌株搖瓶發酵L-異亮氨酸產量達18.5g/L，比原始菌株提高62.03%；Sun等［21］突變了異亮氨酸-tRNA合成酶并構建了基于氨酰基tRNA合成酶全細胞傳感器，該傳感器可特異性識別產高濃度L-異亮氨酸的細胞從而實現高通量篩選。L-異亮氨酸高產菌株的選育需要從更精準的方向深入研究，精準高效的高通量篩選方式也是選育高產菌株的趨勢。

4 結論

通過ARTP結合MMC篩選出一株可適應高濃度α-AB的抗性突變菌株NXU12，經發酵測得該菌株產L-異亮氨酸濃度提高了1.61倍，經基因測序分析發現ilvA部分堿基發生突變，但遺傳穩定性良好，可作為L-異亮氨酸生產備用菌株或構建L-異亮氨酸高產菌株的底盤菌株。等離子誘變結合高通量篩選不僅提高了篩選高產菌株的效率，而且為篩選其他抗性菌株、高產氨基酸菌株提供重要參考。