斑馬魚notch3基因真核表達載體的構建及其表達分析

吳坤坤 徐行 季策 任建峰 李偉明 張慶華

（1. 上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2. 上海海洋大學 國家水生動物病原庫，上海 201306；3. 密歇根州立大學漁業與野生生物系，東蘭辛 48824，美國）

Notch分子是一種跨膜的信號受體，在發育模式、細胞命運決定、細胞生存和增殖調控與免疫等方面都發揮著重要作用［1-2］。Notch信號通路調控著神經細胞增殖、分化和凋亡之間的平衡［1，3］，對細胞分化也起著決定性作用，同時Notch受體還可以通過調節干細胞及其譜系和其他細胞過程，繼續在成人組織的維持和修復中發揮重要作用。notch基因最先在果蠅中被發現，該基因突變可造成黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）翅膀邊緣缺刻（notch），故被命名為notch，果蠅中只有一個notch基因［4］。隨著基因在進化過程中的復制和多樣性變化，在人體中產生了4個Notch同源基因（Notch1-4），它們既有重疊的功能，又有各自的功能［5-6］。Notch分子是單次跨膜分子，在內質網和高爾基體產生，經過Furin蛋白酶切割成熟之后形成一個以非共價鍵結合的單次跨膜蛋白，包括胞內段（notch intracellular domain，NICD）、 跨 膜 區（transmembrane domain，TMD和胞外段（extracellular domain，NECD）3部分［7］。在受到蛋白水解酶切割時被激活是Notch的一個基本特征。在被激活時Notch受體會被金屬蛋白酶和γ-分泌酶切割加工，隨后釋放的Notch受體胞內段NICD進入細胞核，NICD在入核后與DNA結合轉錄因子CSL組成一個臨時的核轉錄復合物。一旦NICD綁定到CSL上，NICD便會募集其他激活蛋白包括Mastermind（MAM）/Lag-3形成三元復合體，進而募集ARCL/MED介導轉錄激活復合物誘導下游靶基因的轉錄表達［8］。

Notch3作為4個Notch分子的一員，在生物的發育、修復和免疫等過程中都發揮著重要作用，特別是在一些疾病中。研究表明，Notch3也有很高的配體非依賴性特征，這可能與Notch3的功能和病理特征有關［9］。在T細胞急性淋巴細胞白血病（T-ALL）中，通過鑒定染色體易位，異常的Notch信號首次與人類癌癥聯系在一起［10］。在很多病例中Notch3的過度表達都是引發疾病的重要原因之一［11-12］。特異性針對Notch3 結構域的阻斷抗體已被證明具有抗白血病的效果［13］。而且Notch3分子同Notch1分子一樣，能夠調節類似的下游致癌基因，包括驅動細胞生長調節因子Myc［14］。另有研究發現，Notch3與NF-κB（nuclear factor-кB）家族關系密切，Notch3受體表達的下調會抑制NF-κB信號通路，而NF-κB信號通路又是免疫學中的重要通路［15］。以上研究表明Notch3在發育和免疫方面都有著重要作用，Notch3分子可能具有復雜的分子調控機制，使其表現出不同的生物學功能。因此，有必要進行詳細的研究。

斑馬魚（Danio rerio）是一種新興的實驗動物，其易于飼養和繁殖，具有透明的胚胎，適合于胚胎發育、神經生成和高通量毒理學等研究。斑馬魚胚胎的透明性允許在發育的所有階段應用高分辨率成像技術。受精后5 d（5 days post fertilization，5 dpf）以內的斑馬魚胚胎被歐盟指令（2010/63/EU）以及美國的實驗動物管理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）視為不受保護的生命階段。因此，斑馬魚胚胎是能夠很好代替其他成年動物的模式生物［16］。在一些微生物感染的實驗中，斑馬魚作為實驗動物的優勢尤為明顯［17］。同時，作為一種脊椎動物，與線蟲和果蠅相比，斑馬魚在進化上與哺乳動物的關系更密切，在一些藥物研究中可以更容易地推斷出在人類中應用的效果［18］。因此，斑馬魚模型具有更強的研究潛力。為了進一步研究Notch3分子在發育、炎癥和天然免疫方面的作用機制，本研究克隆了斑馬魚notch3基因的胞內段（notch3 intracellular domain，N3ICD），并構建了真核表達載體，將其轉染到HEK293T細胞中。亞細胞定位發現重組的真核表達載體可以在細胞核中表達，同時蛋白質印跡（Western blot，WB）結果顯示N3ICD蛋白能夠正常表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚 實驗用AB品系斑馬魚購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所斑馬魚平臺，參照WESTERFIELD要求［19］，飼養于本實驗室的斑馬魚養殖系統中。實驗按照上海海洋大學動物實驗倫理審查委員會（SHOU-DW-2016-002）的要求進行。

1.1.2 實驗細胞 實驗所用HEK293T細胞（人胚腎細胞）由海軍軍醫大學醫學免疫學國家重點實驗室惠贈，本實驗室按照ATCC數據庫方法將細胞進行保種和培養。

1.1.3 主要試劑 普通DNA產物純化試劑盒（TIANGEN，DP204-02），胰蛋白酶TrypLETMExpress（Gibco，1950685），快速質粒小提試劑盒（BIOMIGA，PD1222-01 50）， 簡 單 培 養 基 Opti-MEM（Gibco，1894141），DMEM培養基（HyClone，AD24464275），轉染試劑FuGENE HD Transfection Reagent（Promega，0000352595），哺乳動物表達載體p3XFLAG-CMV-7（SIGMA），同源重組試劑2×ClonExpress Mix（諾唯贊，C115-02-AA），Bovine Serum Albumin（SIGMA，WXBC7961V），20×PBS（ 生 工，D609KA5801），TritonTMx-100（SIGMA，053K00262V），多聚甲醛（ 生 工，CB05BA0005），Alexa FluorTM488goat antimouse lgG9（H+L）（Invitrogen，1834337）， 小 鼠 抗FLAG-tag單克隆抗體（YSASEN，30503ES60），Goat anti-Mouse IgG（H+L）Secondary Antibody，HRP（Invitrogen，31430），β-actin，Rabbit pAb（YSASEN，30102ES40），Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（YSASEN，33101ES60）引物合成及菌液測序均在生工生物工程（上海）有限公司進行。Dual-Luciferase? Reporter Assay System 及 FuGENE Hd均購于Promega公司。實驗涉及NF-κB家族rela和nfκb1基因啟動子報告基因載體 pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer均由本實驗室自行構建。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚notch3胞內段真核表達載體的構建 根據NCBI網站上登錄的斑馬魚notch3基因（NM_131549.2）的CDS區設計的引物如表1所示。以1 dpf的野生型斑馬魚的cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，擴增的體系為：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 12.5 μL，DNA Template 20 ng，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，ddH2O 9.5 μL，擴增的程序為98℃預變性20 s，98℃變性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸1.5 min，共34個循環，72℃終延伸5 min，4℃保存。將PCR產物純化回收，使用限制性內切酶PstⅠ和BamHⅠ對質粒載體p3xFLAG-CMV-7進行雙酶切。載體p3xFLAGCMV-7的質粒圖譜請見http：//www.biofeng.com/zaiti/buru/p3XFLAG-CMV-7.html，將切開的載體用DNA純化試劑盒純化。純化之后用同源重組連接酶2×ClonExpress Mix將PCR純化產物和酶切后的載體p3xFLAG-CMV-7相連接，產物轉化至DH5α感受態細胞中，涂布含有氨芐抗性的平板，12 h后挑單克隆并搖菌，3 h后將部分陽性克隆送測序，另一部分進行保存，將測序成功的菌液提取質粒。

表1 N3ICD引物擴增序列Table 1 N3ICD primer amplification sequence

1.2.2 Notch3氨基酸序列生信分析 利用SMART在線分析斑馬魚Notch3結構域，通過DNAMAN將斑馬魚Notch3氨基酸序列與人（Homo spaiens）、小鼠（Mus musculus）和鯉魚（Cyprinus carpio）的Notch3氨基酸序列進行比對。基于各物種Notch3的氨基酸序列使用MEGA7.0軟件利用鄰接法（NJ）構建系統進化樹。

1.2.3 pCMV-N3ICD亞細胞定位 將構建好的pCMV-N3ICD質粒轉染至HEK293T細胞中。轉染前，將細胞接種到35 mm玻璃底培養皿中，融合率達到70%-80% 時進行轉染。在培養皿用HD轉染試劑將pCMV-N3ICD和pCMV載體質粒各自轉染500 ng。轉染24 h后，將細胞用4%多聚甲醛固定15 min，用1×PBS漂洗3次，并在-20℃下用100%甲醇透化10 min，然后用1×PBS漂洗3次。在封閉緩沖液（1×PBS / 5% 正常山羊血清/0.3% Triton X-100）中將樣品孵育1 h。封閉后，添加抗體緩沖液（1×PBS/1% BSA/0.3% TritonX-100/1∶1 000小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體）4℃下孵育12-16 h。再用1×PBS漂洗3次，加入包含偶聯熒光素二抗并室溫下避光孵育1-2 h，1×PBS漂洗3次，添加DAPI，并將樣品在黑暗中孵育1-2 h。用1×PBS沖洗3次后，在共聚焦顯微鏡下觀察標本并拍照。

1.2.4 斑馬魚N3ICD的蛋白表達分析 將重組質粒pCMV-N3ICD脂質體法轉染HEK293T細胞24 h后提取蛋白。根據BCA 法對蛋白進行定量。取25 μg樣品進行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將樣品轉至NC膜上，封閉10 h，PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以鼠源FLAG-tag抗體為一抗（1∶3 000倍稀釋）并孵育3 h，然后PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以山羊抗鼠為二抗（1∶3 000倍稀釋）孵育3 h，再用PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，ECL顯色，發光，分析Western blot結果。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因活性分析及功能驗證 HEK293T細胞培養于10% FBS-DMEM培養液中，置于5% CO2，37℃無菌培養箱中，每48 h傳代1次。HEK293T細胞轉染前24 h接種于24孔細胞培養板中，接種的細胞密度約5.0×104/孔，匯合率達到80%。具體步驟為：用10 cm細胞培養皿培養HEK293T細胞，待細胞匯合度80%-90%時吸出舊培養基，貼壁加入2 mL DPBS緩沖液，輕輕晃動后吸除DPBS，重復清洗2次。加入500 μL細胞消化胰酶，于37℃培養箱消化1 min，輕敲培養皿底部使貼壁細胞完全脫落，加入10倍體積的DMEM完全培養基（含有10% FBS）終止消化，并轉移至15 mL離心管中800 r/min離心3 min。吸去上清，加入適量DMEM完全培養基重懸細胞，用血球計數板進行計數。24孔板中每孔鋪1×105個細胞，37℃培養。

將斑馬魚真核表達載體pCMV- notch3、NF-κB家族基因啟動子重組質粒pGL3-rela-promoter-Enhancer或 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer和 TK 內參熒光報告基因載體共轉至HEK293T細胞中，檢測過表達notch3基因對下游NF-κB家族rela和nfκb1基因啟動子活性的影響。轉染體系中對照組為：pCMV-Tag2B 400 ng、pCMV- notch3 0 ng、pGL3-relapromoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng；實驗組為：pCMV-Tag2B 100 ng、pCMV- notch3 300 ng、pGL3-rela-promoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng。轉染24 h后按照Dual-Luciferase? Reporter Assay System說明書并用多功能酶標儀（FlexStation3）進行雙熒光素酶報告基因檢測。每組3次技術重復，實驗重復3次，結果用平均值±標準誤（mean±SEM）表示，用Prism 6軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 Notch3氨基酸序列生物信息學分析

生信分析結果顯示斑馬魚Notch3編碼2 468個氨基酸，主要由6個部分構成，23-1 379位點為35個EGF重復序列，1 385-1 503位點為3個NL區域，1 507-1 563位點為NOD結構域，1 575-1 637位點為NODP結構域，1 791-2 003位點為6個ANK結構域，以及2383-2446位點為DUF功能未知的結構域。斑馬魚與鯉魚Notch3氨基酸一致性最高為92.64%，與人和小鼠一致性分別為54.85%和54.15%。用NJ法構建系統進化樹結果表明，哺乳動物Notch3聚為一大支，兩棲類和魚類Notch3聚為另一大支，而斑馬魚的Notch3又與硬骨魚類聚為一支，而哺乳動物各自聚為一個分支（圖1）。

圖1 NJ法構建Notch3進化樹Fig. 1 Construction of Notch3 evolutionary tree by NJ method

2.2 斑馬魚notch3基因胞內段的擴增以及真核表達載體的構建

以1 dpf大小野生型斑馬魚的cDNA為模板，設計引物克隆notch3基因的胞內段。電泳結果顯示，在約2 500 bp處出現單一條帶（圖2），與預測的目的片段大小一致。然后將PCR產物進行純化，純化之后將其與雙酶切后的載體p3xFLAG-CMV用同源重組的方式連接，并經過轉化和菌液PCR篩選出陽性克隆。將構建的真核表達載體命名為pCMVN3ICD，并經測序驗證其與預測信息一致。

圖2 notch3基因胞內段的克隆（A）及重組質粒的構建（B）Fig. 2 Cloning of notch3 gene Intracellular domain（A）and construction of recombinant plasmid（B）

2.3 重組質粒亞細胞定位

為了驗證構建好的重組質粒的表達位置，進行細胞免疫熒光實驗。我們用DAPI試劑標記細胞核（藍色熒光），FLAG抗體標記pCMV-N3ICD（綠色熒光），并進行了明場觀察，pCMV質粒用作對照。在共聚焦顯微鏡下，pCMV-N3ICD聚集在HEK293T細胞核中，這說明成功構建了pCMV-N3ICD真核表達載體（圖 3）。

圖3 pCMV-N3ICD在HEK293T細胞中的定位Fig. 3 Localization of pCMV-N3ICD in HEK293T cells

2.4 利用Western blot分析N3ICD蛋白的表達

為了驗證重組質粒在HEK293T細胞中的表達情況，我們采用了蛋白質免疫印跡法分析。轉染pCMV-N3ICD質粒的實驗組使用Flag抗體出現了明顯的特異性條帶，而轉染p3×FLAG-CMV的載體質粒的對照組中未見相關條帶，表明實驗組有N3ICD目的蛋白的表達（圖4）。

圖4 Western blot檢測N3ICD蛋白的表達（通過Flag標簽顯示）Fig. 4 Expression of N3ICD protein was detected by Western blot（shown by Flag tag）

2.5 過表達斑馬魚notch3基因對NF-κB家族基因啟動子活性的影響

將構建好的重組質粒pCMV-notch3分別與NF-κB家族rela和 nfκb1啟動子報告基因共轉至HEK293T細胞，即在HEK293T細胞中過表達斑馬魚notch3基因，利用雙熒光素酶報告系統檢測細胞中NF-κB家族rela和nfκb1啟動子報告基因的轉錄活性。結果顯示過表達斑馬魚notch3基因后，pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-Enhancer啟 動子的轉錄活性均顯著升高，rela啟動子活性約為對照組的4.5倍，nfκb1轉錄活性約為對照組活性的7倍（圖5）。

圖5 過表達斑馬魚notch3基因Fig. 5 Overexpression of notch3 gene

3 討論

Notch信號是胚胎和成年動物組織中調節細胞命運的重要信號通路。很多研究都表明了其在發育中的重要作用，在哺乳動物中，Notch和TGF信號通路的相互調節可以延緩腎間質纖維化的進程［20］。同時，Notch 信號通路參與調控肺動脈內皮細胞的凋亡及肺動脈血管平滑肌細胞表型轉換的過程，可以導致肺動脈高壓肺血管重構的發生［21］。此外，Notch信號被認為是影響腫瘤細胞與腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的重要通路之一，Notch 信號能夠介導許多分子的分泌，從而影響TME 中的細胞功能［22］。還有研究表明Notch1和Notch3之間的相互作用促進了鱗狀細胞癌的增殖及上皮間質轉化和腫瘤的發生［23］。最近的研究發現，Notch3對發育和人類的健康都十分重要，Notch3也越來越受到關注，如Notch3信號傳導的異常會促進血管的過度出芽［24］，還能夠影響常染色體顯性遺傳腦動脈病以及癌癥等［25］。然而，相較于Notch3，Notch家族的其他成員具有更明顯的多效性作用，所以對于Notch3的研究還不深入。本研究構建了斑馬魚N3ICD真核表達載體，對其序列特征進行了生物信息學分析，并從測序、亞細胞定位和Western blot等方面進行了驗證，旨在進一步研究Notch3不同于其他Notch蛋白的獨特調控方式，為探究Notch3在發育和免疫中的功能打下基礎。同時為Notch3的異常表達和調控而導致的疾病，開發出更具針對性的治療方案提供幫助。

近年來，越來越多的證據表明，Notch信號參與了天然免疫反應的調節，特別是巨噬細胞活化和極化的調控。在過去的幾年中，多項研究表明，Notch信號在髓樣細胞（尤其是巨噬細胞）的分化和激活中具有關鍵作用［26］，并參與炎癥性相關疾病的發生。在不同的炎癥疾病模型中，Notch受體表達的增加能夠引起病理性炎癥［27］。Notch3通過其活性、表達改變或錯誤調節與人類疾病密切相關。在大腸癌患者中，Notch3表達與腫瘤分級，淋巴結的存在以及遠端轉移呈正相關，并且在間質大腸癌腫瘤中特異上調［28］。同時在哺乳動物中Notch3在炎癥控制時也起重要作用，有報道顯示Notch3能夠影響NF-κB活化和促炎巨噬細胞的發育，Notch3可以促進NF-κB的激活并能夠促進由TLR-4激活的巨噬細胞中促炎基因的表達［29］。在上述結果中，我們所構建的N3ICD真核表達載體能夠明顯增強NF-κB家族中rela和nfκb1啟動子的活性。這不僅說明了我們構建的真核表達載體能夠正常表達并行使功能，也進一步證明了Notch3與NF-κB家族密切相關，并能夠影響NF-κB通路的活化，由此可見Notch3在炎癥反應和免疫應答中也發揮著重要作用。我們的實驗結果能夠為今后于斑馬魚中深入研究Notch3在發育生物學、先天免疫及炎癥等方面的功能提供幫助。

4 結論

本研究成功構建了斑馬魚N3ICD真核表達載體，并進行了表達分析，所構建的N3ICD真核表達載體能夠對NF-κB家族中rela和nfκb1啟動子的活性產生影響，使其活性明顯升高。