羊α干擾素在家蠶中的表達(dá)及抗小反芻獸疫病毒活性測(cè)定

李丹 杜夢(mèng)潭 修明霞 劉興健 張志芳 李軼女

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2. 乳山市果茶蠶工作站，煙臺(tái) 264500）

干擾素（interferons，IFNs）是病毒或其他誘生劑刺激機(jī)體后產(chǎn)生的高活性糖蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性。1957年，英國(guó)病毒生物學(xué)家Isaacs在流感病毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)病毒感染的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生某種因子，可以干擾病毒在其它細(xì)胞中的復(fù)制，因此將其命名為干擾素［1］。近年來(lái)，干擾素在病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用于治療畜禽的病毒性疾病及腫瘤性疾病，并取得良好的效果［2］。此外，由于其治療周期短、能有效預(yù)防繼發(fā)感染、減少抗生素使用等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視。

根據(jù)其結(jié)合的特異性受體差異，干擾素可被分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型干擾素有IFN-α、IFN-β等，IFN-α根據(jù)氨基酸序列不同，又將分為IFN-α-2a、IFN-α-1b、IFN-α-2b等，I型干擾素具有很強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤活性，對(duì)病毒感染引起的免疫反應(yīng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前，I型干擾素的研究被廣泛關(guān)注，已經(jīng)成為病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。Ⅱ型干擾素為IFN-γ，其主要功能是誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）類抗原的表達(dá)和進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，但其抗病毒作用弱于I型干擾素［3］。I型干擾素與Ⅱ型干擾素在理化特性及生物學(xué)活性上具有明顯的差異，如I型干擾素能夠耐受pH 2.0的酸性條件，而Ⅱ型干擾素則會(huì)失活［4］。Ⅲ型干擾素為IFN-λ，于2013年首次被發(fā)現(xiàn)［5-6］，具有廣譜的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)活性［7］。

IFN-α屬于I型干擾素，具有高度的同源性和明顯的種族特異性，人的干擾素由約165個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為19 kD［8-9］，主要由B淋巴細(xì)胞及部分巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［10］。IFN-α可以通過(guò)增強(qiáng)NK細(xì)胞活性、促進(jìn)B細(xì)胞增生來(lái)提高體液免疫活性，實(shí)現(xiàn)一定的抗病毒作用。此外，IFN-α可上調(diào)Th細(xì)胞上白細(xì)胞介素受體、主要組織相容性復(fù)合體 I、Ⅱ類分子的表達(dá)，增強(qiáng)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，通過(guò)多種病毒相互作用途徑調(diào)節(jié)免疫活性［11］。由于IFN-α具有良好抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床［12-14］，如抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等［15］。

小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV），屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，主要感染山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物［16］，給全球畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的損失［17］。本研究將羊α干擾素基因序列進(jìn)行優(yōu)化合成，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)細(xì)胞病變抑制法在BHK-VSV*GFP系統(tǒng)中檢測(cè)其抗病毒活性，并對(duì)其抑制小反芻獸疫病毒增殖活性進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；BamH I、EcoR I限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker購(gòu)自Thermo Scientific公司；實(shí)驗(yàn)用家蠶（JY1）來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所；脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；病毒基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393、失活拯救型穿梭質(zhì)粒reBmBac、家蠶卵巢細(xì)胞系（BmN）、重組表達(dá)綠色熒光蛋白的水皰型口炎病毒（VSV- GFP）、幼地鼠腎細(xì)胞（BHK）皆由本實(shí)驗(yàn)室保存；小反芻獸疫病毒疫苗（Clone9株）購(gòu)自天康生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的優(yōu)化合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目前已公布的羊α干擾素所有亞型的氨基酸序列，利用MEGA軟件［18］進(jìn)行序列比對(duì)，篩選最優(yōu)氨基酸序列，并通過(guò)SignalP、TMHMM軟件對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)及跨膜區(qū)分析，選擇分泌效率高的信號(hào)肽序列。根據(jù)家蠶密碼子偏好性對(duì)相應(yīng)基因序列進(jìn)行優(yōu)化合成，在其上游添加Kozak序列提高翻譯效率，下游添加終止密碼子終止翻譯。利用DNAMAN進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析后，將該序列5′端添加BamH I酶切位點(diǎn)，3′端添加EcoR I酶切位點(diǎn)便于克隆操作，優(yōu)化后的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的基因序列連接在pUC57載體上，命名為pUC57-OviIFN-α。

1.2.2 pVL1393-OviIFN-α轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將合成后的質(zhì)粒pUC57-OviIFN-α及桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393利用 BamH I、EcoR I于 37℃酶切 30 min，pUC57- OviIFN-α酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將大小不同的片段分離，用膠回收試劑盒回收OviIFN-α基因片段。pVL1393酶切產(chǎn)物經(jīng)85℃滅活10 min后，與OviIFN-α片段以1∶6的比例混合，在T4DNA連接酶的作用下，于25℃連接10 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐抗性（60 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性菌落。挑取單菌落于4.5 mL含有相同濃度氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約12 h，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并用BamH I、EcoR I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并將其命名為pVL1393-OviIFN-α。

1.2.3 重組桿狀病毒的構(gòu)建及在家蠶中的表達(dá) 將轉(zhuǎn)移載體pVL1393-OviIFN-α與失活拯救型穿梭質(zhì)粒reBmBac利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，于27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約5.5 d，待大量細(xì)胞病變后收取細(xì)胞培養(yǎng)液，即重組病毒，置于4℃保存，經(jīng)毒株純化實(shí)驗(yàn)后，保存為毒種。將重組病毒液按照105PFU /頭注射5齡起蠶，同時(shí)設(shè)置親本病毒感染的家蠶作為對(duì)照，待達(dá)到家蠶預(yù)期的表達(dá)高峰時(shí)收取表達(dá)產(chǎn)物。利用試劑盒提取蠶血淋巴中的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物對(duì)病毒基因組DNA中OviIFN-α部分片段進(jìn)行PCR鑒定。上游引物 5′-CTGCGACTTGCCACACAACCAC-3′；下游引物5′-TTACGGTGAAGCCAAATCGCCG-3′，預(yù)期擴(kuò)增出片段大小為520 bp。

1.2.4 重組羊干擾素α的抗病毒活性檢測(cè) 將表達(dá)樣品用PBS稀釋10倍后進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，在BHK細(xì)胞中利用微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)干擾素對(duì)VSV病毒復(fù)制的抑制作用，具體操作步驟參考文獻(xiàn)［19］中的方法。根據(jù)VSV*GFP在495 nm處有吸收峰的特點(diǎn)，在顯微鏡中對(duì)各組熒光情況進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)，利用Reed-Muench法計(jì)算干擾素的抗病毒活性。

1.2.5 PPRV病毒滴度測(cè)定 將BHK細(xì)胞以104cell/孔鋪于96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將PPRV疫苗株從10-1進(jìn)行10倍倍比稀釋至10-10，每孔100 μL加到上述96孔板中，同時(shí)設(shè)置空白細(xì)胞對(duì)照組，每天通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，利用Reed-Muench法計(jì)算PPRV病毒的TCID50。

1.2.6 干擾素抑制PPRV增殖活性檢測(cè) 將表達(dá)樣品以適當(dāng)倍數(shù)稀釋后以上述1.2.4中的方法在BHK細(xì)胞中孵育24 h，棄掉上清液，加入100 TCID50的PPRV 疫苗株病毒，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約36 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，待病毒對(duì)照組全部發(fā)病時(shí)開始記錄，通過(guò)Reed-Muench法計(jì)算羊α干擾素半數(shù)抑制PPRV所需的單位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 OviIFN-α基因的優(yōu)化合成與重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將查找的羊α干擾素氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列號(hào)為CAA41790.1及CAA41791.1的氨基酸序列與其它亞型一致性較高。對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)及跨膜區(qū)分析顯示，其1-23位為信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)。我們選擇登錄號(hào)為CAA41790.1的信號(hào)肽，其余序列選擇登錄號(hào)為CAA41791.1的氨基酸序列。羊α干擾素由195個(gè)氨基酸組成，根據(jù)家蠶密碼子偏好性對(duì)相應(yīng)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，去除原始序列中高GC含量區(qū)，使得GC含量達(dá)到49.92%。CAI值為0.94，表明該基因序列的密碼子使用情況較為理想，優(yōu)化后的基因序列包含588個(gè)堿基。將合成的OviIFN-α經(jīng)過(guò)BamH I、EcoR I雙酶切后連接在轉(zhuǎn)移載體pVL1393上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑斑篩選出陽(yáng)性菌落，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，在580 bp及大于9 600 bp附近分別出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將其送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的序列相符，表明成功構(gòu)建pVL1393-OviIFN-α轉(zhuǎn)移載體。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.2 家蠶中重組桿狀病毒的PCR鑒定

為了確定目的基因是否成功重組到桿狀病毒基因組中，并能在家蠶中復(fù)制，將羊α干擾素處理組及對(duì)照組家蠶的表達(dá)產(chǎn)物提取病毒基因組DNA，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，以O(shè)viIFN-α樣品基因組DNA為模板時(shí)，PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的清晰條帶，而對(duì)照中則沒(méi)有條帶出現(xiàn)，表明目的基因成功重組到桿狀病毒基因組中。

圖2 重組病毒感染家蠶后蠶血淋巴中目的基因的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the target gene in the hemolymph of the silkworm infected with the recombinant virus

2.3 羊α干擾素抗病毒活性檢測(cè)

采用微量細(xì)胞病變抑制法對(duì)羊α干擾素抑制VSV病毒活性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)100 TCID50單位的VSV病毒感染細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光（圖3-C），加入少量干擾素時(shí)可部分抑制病毒感染，顯微鏡中會(huì)出現(xiàn)少量熒光（圖3-B），而當(dāng)干擾素濃度較高時(shí)能完全抑制病毒復(fù)制，則不會(huì)有熒光出現(xiàn)（圖3-A），空白細(xì)胞對(duì)照組同樣不會(huì)出現(xiàn)熒光（圖3-D）。我們從病毒對(duì)照組8個(gè)復(fù)孔全部發(fā)病時(shí)開始記錄，其結(jié)果如表1所示，當(dāng)蠶血樣品稀釋1.0×104倍時(shí)能夠完全抑制VSV*GFP病毒感染，無(wú)熒光蛋白產(chǎn)生；稀釋4.0×104倍時(shí)不能完全抑制病毒感染，部分產(chǎn)生熒光蛋白，稀釋3.2×105倍時(shí)已不能抑制病毒感染，復(fù)孔中都有大量熒光蛋白產(chǎn)生，經(jīng)統(tǒng)計(jì)后其熒光產(chǎn)生情況如表1所示，利用Reed-Muench法對(duì)其抗病毒效價(jià)進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得出重組羊α干擾素的表達(dá)量為6.5×105U/mL左右。

表1 重組羊α干擾素在BHK細(xì)胞中抑制VSV*GFP病毒活性檢測(cè)Table 1 Recombinant goat interferon alpha inhibits VSV*GFP virus activity in BHK cells

圖3 不同濃度干擾素處理組后BHK細(xì)胞感染VSV增殖情況Fig. 3 Proliferation of BHK cells infected with VSV after treatment with different concentrations of interferon

2.4 PPRV病毒滴度測(cè)定

PPRV感染BHK細(xì)胞36 h時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），細(xì)胞收縮，形態(tài)發(fā)生改變，并出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，形成合胞體。觀察各孔細(xì)胞病變情況并記錄，結(jié)果如表2所示，利用Reed-Muench法計(jì)算其TCID50，為每1 mL 106TCID50。

表2 PPRV的TCID50測(cè)定結(jié)果Table 2 TCID50 measurement results of PPRV

2.5 羊α干擾素抑制PPRV增值效果測(cè)定

將不同濃度的羊α干擾素用于抑制PPRV病毒在BHK細(xì)胞中的復(fù)制，抑制情況分為以下4種：PPRV感染BHK細(xì)胞病毒后，出現(xiàn)明顯的合胞體（圖4-A）；當(dāng)加入干擾素能完全抑制PPRV增殖，細(xì)胞不發(fā)生病變（圖4-B）；當(dāng)干擾素能部分抑制PPRV復(fù)制時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)少量合胞體；空白細(xì)胞對(duì)照組則不會(huì)發(fā)生病變（圖4-C）。以病毒組復(fù)孔半數(shù)發(fā)生病變?yōu)槠瘘c(diǎn)開始觀察，以病毒組復(fù)孔全部發(fā)生病變?yōu)榻y(tǒng)計(jì)終點(diǎn)，記錄合胞體出現(xiàn)情況，利用Reed-Muench法對(duì)羊α干擾素抑制PPRV病毒效價(jià)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，干擾素對(duì)PPRV復(fù)制的半抑制濃度IC50為 136.93 U。

圖4 羊α干擾素抑制BHK細(xì)胞感染PPRV增殖效果圖Fig. 4 Effects of OviIFNα on inhibiting the proliferation of BHK cells infected with PPRV

3 討論

家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前廣泛應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)［20］表達(dá)羊α干擾素。該系統(tǒng)將家蠶桿狀病毒BmNPV進(jìn)行基因修飾，并缺失其復(fù)制所必須的ORF1629基因，構(gòu)建相應(yīng)的失活拯救型穿梭載體pVL1393，使得共轉(zhuǎn)染時(shí)只有外源基因插入的桿狀病毒才能進(jìn)行復(fù)制，該策略使重組效率理論上提高到100%，為羊α干擾素的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。另外，相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，具有乙酰化、糖基化等翻譯后修飾功能，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與天然蛋白相似，有利于生產(chǎn)具有更高比活的羊α干擾素。本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的羊α干擾素，在BHK-VSV*GFP系統(tǒng)中檢測(cè)到其表達(dá)量可達(dá)6.5×105U/mL。由于本實(shí)驗(yàn)室在之前的豬、雞、犬等干擾素的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家蠶幼蟲或蠶蛹的蛋白，正常桿狀病毒及其表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞病變抑制法中都無(wú)抗病毒活性［20-21］，因此在檢測(cè)干擾素抗病毒活性時(shí)，沒(méi)有設(shè)置正常蠶血組作為對(duì)照。此外，由于羊α干擾素具有很強(qiáng)的種屬特異性，該抑制實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在相應(yīng)羊來(lái)源細(xì)胞系進(jìn)行，但由于成熟的羊來(lái)源的細(xì)胞系較為稀少，故先選擇鼠源細(xì)胞（BHK）進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，因此，該干擾素在羊來(lái)源細(xì)胞中對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

信號(hào)肽在外源蛋白的分泌時(shí)發(fā)揮重要作用，它能引導(dǎo)新生肽段穿越真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，避免產(chǎn)物大量聚集在細(xì)胞中，影響細(xì)胞活性。因此，在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)羊α干擾素時(shí)需要保留信號(hào)肽序列。但不同的信號(hào)肽序列有不同的分泌和切割能力，通過(guò)查找GenBank中羊α干擾素不同亞型的信號(hào)肽序列，根據(jù)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)得分及S值變化趨勢(shì)，篩選出分泌效率高的信號(hào)肽序列登錄號(hào)為（CAA41790.1）用于本次表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

I型干擾素是機(jī)體固有免疫應(yīng)答中一類重要的細(xì)胞因子，具有廣譜的抗病毒及抗腫瘤等作用［22］。干擾素α屬于I型干擾素中重要的一種，它既能抑制病毒復(fù)制，又能調(diào)節(jié)宿主免疫功能，其對(duì)各種類型細(xì)胞的功能都有廣泛的影響。研究表明，病毒感染早期給予外源性IFN-α，可以激活干擾素誘導(dǎo)的抗病毒狀態(tài)，并使NK細(xì)胞表達(dá)穿孔素和顆粒酶A，從而增加宿主抗病毒的能力［23］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇α干擾素進(jìn)行抗病毒活性研究，表達(dá)具有高效、廣譜抗病毒活性的羊α干擾素。

多年來(lái)，小反芻獸疫疫情不斷在國(guó)內(nèi)及周邊國(guó)家出現(xiàn)，對(duì)全球的羊養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的威脅，減毒活疫苗是目前市場(chǎng)上常用的方法，但其具有安全性低，不能區(qū)分自然感染動(dòng)物與免疫動(dòng)物等缺點(diǎn)，為小反芻獸疫疫情的防控帶來(lái)了很大的困難，而干擾素具有毒副作用小、抗原性弱，可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)病毒性感染引起的疫情防控具有積極地作用。近年來(lái)，干擾素已經(jīng)被廣泛用于多種動(dòng)物的抗病毒作用研究，并取得了一定的進(jìn)展，目前市場(chǎng)上商品化的豬、犬、雞等重組干擾素產(chǎn)品已應(yīng)用于實(shí)踐。本實(shí)驗(yàn)將羊α干擾素用于抑制小反芻獸疫病毒增殖研究，結(jié)果顯示僅需136.93 U就可以對(duì)PPRV 病毒的復(fù)制產(chǎn)生明顯的抑制作用，該結(jié)果有望為小反芻獸疫疫情防控提供新的方法。

4 結(jié)論

本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了羊α干擾素，經(jīng)BHK-VSV*GFP系統(tǒng)檢測(cè)到該干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒活性，為大量生產(chǎn)廉價(jià)且高效的羊α干擾素提供了一種新的方法。另外，該干擾素在對(duì)PPRV病毒的抑制實(shí)驗(yàn)中顯示出較強(qiáng)的抗病毒作用，為干擾素用于PPRV疫情的防控提供了理論基礎(chǔ)。