林麝干擾素α基因克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

楊威 伍茜 程建國(guó) 羅燕 王印 楊澤曉 姚學(xué)萍

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2. 四川養(yǎng)麝研究所，成都 611800）

林麝（forest musk deer，F(xiàn)MD）已列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ，也是我國(guó)一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，其雄性分泌的麝香為名貴的中藥材和高級(jí)動(dòng)物香料，具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1-2］。由于生態(tài)環(huán)境的破壞及過(guò)度的捕殺，野麝資源瀕臨滅絕，麝香資源瀕于枯竭。由于麝資源匱乏和麝香在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)供不應(yīng)求的矛盾，人工養(yǎng)麝前景十分廣闊。國(guó)際國(guó)內(nèi)保護(hù)條例規(guī)定只有人工養(yǎng)麝獲取的麝香才允許進(jìn)行合法的國(guó)際國(guó)內(nèi)貿(mào)易［3］。但是目前對(duì)麝的一些疾病發(fā)生機(jī)制不甚了解，病原體的檢測(cè)技術(shù)不夠成熟，防治手段過(guò)于有限，林麝病癥不易外顯等原因，導(dǎo)致人工養(yǎng)殖林麝繁殖成活率偏低、群體死亡率高。目前，關(guān)于林麝疾病的研究報(bào)道中，除了研究較多的各類(lèi)細(xì)菌導(dǎo)致的疾病外，也有林麝感染病毒死亡的相關(guān)報(bào)道［4］。因此，對(duì)林麝病毒性疾病的防治對(duì)林麝人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

自1957年干擾素（interferon，IFN）被發(fā)現(xiàn)后的半世紀(jì)以來(lái)，干擾素一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。干擾素的生物學(xué)活性具有相對(duì)種屬特異性，即某一種屬動(dòng)物產(chǎn)生的IFN只能對(duì)同種屬或種屬非常接近的動(dòng)物有保護(hù)力。同時(shí)，干擾素的抗病毒作用是廣譜的［5］。干擾素是通過(guò)刺激機(jī)體自身抗病毒蛋白的表達(dá)來(lái)提升機(jī)體對(duì)病毒的抵抗作用從而達(dá)到抗病毒目的［6］。因此，干擾素在病毒性疾病的防治上，具有廣闊的前景。

近年來(lái)，隨著干擾素在一些畜禽病毒性疾病及腫瘤性疾病的治療方面取得良好療效，獸醫(yī)科研工作者愈加重視干擾素在動(dòng)物體內(nèi)的免疫特性及其臨床制品的研究，大熊貓、狐貍、水貂、貉等越來(lái)越多動(dòng)物的IFN基因相繼被研究報(bào)道，動(dòng)物基因工程干擾素的應(yīng)用也會(huì)越來(lái)越廣泛［7-9］。林麝干擾素具有很高的臨床應(yīng)用前景，研究林麝干擾素對(duì)林麝病毒性疾病的防治有重大意義。因此，本研究對(duì)林麝干擾素α進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)林麝干擾素α進(jìn)行了外源表達(dá)，并對(duì)林麝干擾素α抗增殖作用和刺激抗病毒蛋白轉(zhuǎn)錄作用進(jìn)行了研究，為林麝干擾素α的應(yīng)用提供相關(guān)理論基礎(chǔ)，也為林麝病毒性疾病的防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

林麝血液采集于四川養(yǎng)麝研究所。畢赤酵母X33、表達(dá)載體pPICZα A、林麝肺臟成纖維細(xì)胞FMD-C1由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生化科技有限公司；pMD19-T載體和T4連接酶購(gòu)自大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；2×Pfu PCR Mix、2×Taq PCR MasterMix和DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于成都福際生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、CCK-8、小鼠抗6×His單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG單克隆抗體和DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和SYBR Green 染料法Mix購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。快速內(nèi)切酶EcoR I、Not I和Sac I均購(gòu)自莫納生物科技有限公司。氨芐青霉素、Zeocin、超濾離心管和酵母基因組提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。澳洲胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 根據(jù)有關(guān)動(dòng)物保護(hù)法，于林麝外周靜脈取血，枸櫞酸-枸櫞酸鹽-葡萄糖（ACD）抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞（PBMC），PBMC在1 μg/mL的刀豆蛋白A（ConA）誘導(dǎo)下37℃培養(yǎng)48 h后，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明，提取細(xì)胞總RNA，利用cDNA合成試劑盒合成cDNA，存于-70℃超低溫冰箱中。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與基因克隆 根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)已上傳的林麝近親物種牛、綿羊、山羊等IFN-α的核苷酸序列與林麝已上傳的基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)克隆林麝IFN-α（FMD-IFNα）基因的引物與干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的特異引物。本試驗(yàn)檢測(cè)的林麝ISG為2′-5′-寡腺苷酸合成酶（2′-5′-oligoadenylate synthase，OAS）、病毒抑制蛋白Viperin（VIP）、黏病毒抵抗蛋白1（myxovirus resistance 1，Mx1）、干擾素刺激基 因 15（interferon-stimulated gene 15，ISG15） 和干擾素刺激基因56（interferon-stimulated gene 56，ISG56），并以β-actin為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

以林麝外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板，IFN-α F/R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA凝膠回收純化試劑盒回收目的基因片段，并與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。以IFN-α F/R及M13 F/R為引物對(duì)鑒定轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 林麝IFN-α的生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果信號(hào)峰圖使用Snapgene軟件校對(duì)，用DNAStar分析軟件分析比較，與GenBank公開(kāi)的其他物種IFNα的基因序列進(jìn)行同源性分析。運(yùn)用ExPASy的ProtParam軟件分析FMD-IFNα蛋白編碼氨基酸的理化性質(zhì)、MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、NCBI中BLAST在線分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、SignalP 5.0 Server軟件分析信號(hào)肽預(yù)測(cè)及跨膜區(qū)、PSIPRED程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 重組畢赤酵母pPICZα-IFNα-X33的構(gòu)建 復(fù)蘇測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性的大腸桿菌，使用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取pMD19-T-IFNα質(zhì)粒。將pMD19-TIFNα質(zhì)粒作為模板，以ExIFNα-F/R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得表達(dá)片段。將表達(dá)片段和pPICZα A使用內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收純化。使用T4連接酶連接FMD-IFNα表達(dá)片段與pPICZα A，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZα-IFNα，并轉(zhuǎn)化DH5α。用含有20 μg/mL Zeocin抗生素的 LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。分別以ExIFNα-F/R和AOX I-F/R為引物，對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定并送測(cè)序。

擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并提取pPICZα-IFNα質(zhì)粒，并使用內(nèi)切酶Sac I將其線性化。按照文獻(xiàn)［10］的方法制備畢赤酵母感受態(tài)，將線性化后的pPICZα-IFNα與畢赤酵母感受態(tài)混合，使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。以 YPD 平板（100 μg/mL Zeocin）于 30℃培養(yǎng)酵母轉(zhuǎn)化子，并提取酵母轉(zhuǎn)化子基因組DNA。以轉(zhuǎn)化子DNA為模板，ExIFNα-F/R和AOX I-F/R為引物，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序。

1.2.5 FMD-IFNα蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽(yáng)性重組子接種于BMGY培養(yǎng)基中，在30℃條件下220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到2.0-6.0，離心收集菌體，使用適量體積BMMY培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，在30℃，220 r/min條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h向培養(yǎng)基添加甲醇至終濃度為1%，誘導(dǎo)表達(dá)72 h。誘導(dǎo)結(jié)束的培養(yǎng)基離心取上清液，使用超濾離心管對(duì)上清液進(jìn)行濃縮。取濃縮的上清液進(jìn)行SDS-PAGE、Western blot分析，具體方法參考［11］。成功表達(dá)目的蛋白的陽(yáng)性酵母重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)甲醇濃度優(yōu)化和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化。甲醇濃度優(yōu)化為陽(yáng)性重組子于0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甲醇濃度下，誘導(dǎo)表達(dá)72 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。表達(dá)時(shí)間優(yōu)化為陽(yáng)性重組子于1.0%的甲醇誘導(dǎo)濃度下，在誘導(dǎo)24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。使用Ni-NTA蛋白純化試劑盒純化FMD-IFNα，并使用超濾管濃縮除鹽，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 林麝IFN-α刺激林麝肺成纖維細(xì)胞FMD-C1 以10%胎牛血清濃度的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5% CO培養(yǎng)FMD-C1細(xì)胞。將5×105個(gè)/mL，

22 mL/孔的FMD-C1細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底的80%時(shí)，加入FMD-IFNα刺激細(xì)胞。劑量依賴(lài)性檢測(cè)：加入細(xì)胞培養(yǎng)液中的FMD-IFNα終濃度分別為400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和50 ng/mL，以不加FMD-IFNα孔作為對(duì)照，孵育12 h，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。時(shí)間依賴(lài)性檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入400 ng/mL的FMD-IFNα，并分別于培養(yǎng)6 h、12 h、18 h和24 h后，提取細(xì)胞總RNA，以未加入FMD-IFNα孔作為對(duì)照進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.7 qPCR檢測(cè)林麝IFN-α對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因表達(dá)影響 以FMD-C1 cDNA為模板，ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）和β-actin引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR獲得目的片段，并連接pMD-19T構(gòu)建重組質(zhì)粒。使用重組質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)品，并以其為模板進(jìn)行qPCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶解曲線，計(jì)算引物的擴(kuò)增效率（Efficiency）與相關(guān)系數(shù)（r2）。再使用ISG與β-actin-F/R為引物，F(xiàn)MD-C1 cDNA為模板進(jìn)行qPCR，檢測(cè)各個(gè)樣本中相關(guān)基因的Ct值，以Pfaffle法［12］進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算。Pfaffle法計(jì)算公式為：

1.2.8 林麝IFN-α對(duì)林麝肺成纖維細(xì)胞FMD-C1的增殖抑制檢測(cè) 以 1×105個(gè) /mL，100 μL/孔的FMD-C1細(xì)胞濃度接種于96孔板，于37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，分別加入至終濃度為400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和 50 ng/mL的 FMD-IFNα，以不加FMD-IFNα孔作為對(duì)照，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔450 nm吸光度，使用600 nm的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100。

2 結(jié)果

2.1 FMD-IFNα基因序列的擴(kuò)增與克隆

林麝外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板，IFN-α F/R為引物，PCR擴(kuò)增獲得約570 bp特異片段（圖1-A）。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-FMD-IFNα經(jīng)M13-F/RPCR擴(kuò)增獲得680 bp特異片段，符合試驗(yàn)預(yù)期（圖1-B）。

圖1 FMD-IFNα的克隆及鑒定Fig. 1 Cloning and identification of FMD-IFNα

2.2 FMD-IFNα基因序列比對(duì)

通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子測(cè)序，本次實(shí)驗(yàn)獲得9種FMD-IFNα亞 型， 分 別 命 名 為 FMD-IFNα1-FMD-IFNα9，基因序列均為570 bp，編碼189個(gè)氨基酸。9種FMD-IFNα亞型的序列已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MW394230-MW394238。9種FMD-IFNα的氨基酸序列對(duì)比圖見(jiàn)圖2，其中包括了親緣關(guān)系較近的牛（BosIFN-αA），與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的野豬（SusIFN-α4）和人（HomoIFN-α2）。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)MDIFN-α前23位氨基酸為信號(hào)肽。9種FMD-IFN-α均包含4個(gè)半胱氨酸殘基，它們位于成熟蛋白序列的1、29、99和139位，可形成兩個(gè)二硫鍵，與其他哺乳動(dòng)物IFN-α中的保守半胱氨酸一致。同時(shí)在4、26、39、110和139位含有的5個(gè)脯氨酸也與哺乳動(dòng)物IFN-α 5個(gè)保守脯氨酸位點(diǎn)一致。

圖2 各亞型FMD-IFNα氨基酸序列同源性Fig. 2 Homology of amino acid sequence of each subtype of FMD-IFNα

9種亞型之間，核酸序列同源性為97.0%-99.6%，氨基酸序列同源性為93.7%-99.5%。FMDIFNα與同為反芻亞目的牛（BosIFN-αA）、山羊（CapraIFN-α）、印度黑羚（CervicapraIFN-α）、綿羊（OvisIFN-α1）的核苷酸同源性均大于94%，氨基酸序列同源性大于88%；與野豬（SusIFN-α4）的核苷酸同源性低于84%，氨基酸同源性低于70.9%；與人（HomoIFN-α2）的核苷酸同源性低于80.2%，氨基酸同源性低于65.4%。

利用MEGA 7.0軟件鄰近法對(duì)林麝、牛、綿羊、山羊、印度羚羊和作為外群物種的人和野豬的IFN-α氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建，步長(zhǎng)檢驗(yàn)為1 000次，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，林麝與綿羊、山羊、牛、印度羚羊共同構(gòu)成一個(gè)主要分支，置信度為100，同時(shí)，9種林麝干擾素α再單獨(dú)形成一支。人和野豬（外群）分別形成一個(gè)單獨(dú)分支。

圖3 IFNα氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of IFNα amino acid sequence

鑒于9條FMD-IFNα的核苷酸序列與氨基酸序列的高同源性，后續(xù)信號(hào)肽預(yù)測(cè)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖均以FMD-IFNα1亞型為代表進(jìn)行展示。FMD-IFNα信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明FMD-IFNα的前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)由166個(gè)氨基酸組成。FMD-IFNα理化性質(zhì)分析結(jié)果表明成熟FMD-IFNα蛋白分子質(zhì)量為18.9 kD，等電點(diǎn)為8.46。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明IFN-α成熟蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由5個(gè)主要的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。FMDIFNα的三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4，與牛、人的干擾素α的三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似，均具有5個(gè)明顯的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖4 干擾素α三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig. 4 Comparison of the tertiary structure of interferon-α

林麝IFNα成熟蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。IFN-α成熟蛋白質(zhì)第3-162位氨基酸構(gòu)成一個(gè)干擾素α/β結(jié)構(gòu)域；第3-155位氨基酸序列構(gòu)成 I型干擾素結(jié)構(gòu)域，屬于較大的螺旋狀細(xì)胞因子超家族。氨基酸序列的第5-20位和第77-99位分別包含一個(gè)IFNAR-1結(jié)合位點(diǎn)，第30-48位和第118-137位分別包含一個(gè)IFNAR-2結(jié)合位點(diǎn)。第78位氨基酸預(yù)測(cè)為N -糖基化位點(diǎn)，為保守結(jié)構(gòu)域IFab上的N-糖基化位點(diǎn)。

圖5 FMD-IFNα成熟蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 5 Prediction of the conserved domains of FMD-IFNα

2.3 FMD-IFNα的誘導(dǎo)表達(dá)

本試驗(yàn)選擇FMD-IFNα1亞型進(jìn)行外源表達(dá)及后續(xù)試驗(yàn)。以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的pMD19-T-IFNα質(zhì)粒為模板，ExIFNα-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果見(jiàn)圖6-A，在約500 bp處有明顯條帶，符合預(yù)期。pPICZα-IFNα的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6-B，符合預(yù)期大小1 044 bp，測(cè)序結(jié)果也符合預(yù)期，表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖6 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of PCR products

PCR鑒定pPICZα-IFNα電轉(zhuǎn)化的畢赤酵母，結(jié)果見(jiàn)圖7。以ExIFNα-F/R和AOX1-F/R為引物的PCR產(chǎn)物均符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果正確，重組畢赤酵母pPICZα-IFNα-X33構(gòu)建成功。

圖7 陽(yáng)性畢赤酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig. 7 PCR identification results of positive Pichia pastoris transformants

pPICZα-IFNα-X33初步誘導(dǎo)表達(dá)上清液的SDSPAGE電泳和Western blot均在15-25 kD之間有一明顯蛋白條帶（圖8），符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。畢赤酵母表達(dá)的時(shí)間優(yōu)化和濃度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果表明pPICZα-IFNα-X33誘導(dǎo)表達(dá)的最佳甲醇濃度為1%，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。

圖8 FMD-IFNα初步誘導(dǎo)結(jié)果Fig. 8 Preliminary expression results of FMD-IFNα

圖9 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化結(jié)果Fig. 9 Recombinant Pichia pastoris induced expression optimization results

2.4 林麝IFN-α對(duì)其通路上抗病毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

林麝ISG和β-actin引物的qPCR熔解曲線均呈單一峰，無(wú)雜峰，引物特異性良好；OAS、Viperin、Mx1、ISG15、ISG56和 β-actin的 擴(kuò) 增 效 率 分 別為 103.5%、107.9%、104.1%、100.1%、91.5% 和102.9%，符合qPCR引物要求；r2均大于0.99，具有良好的線性相關(guān)性。

FMD-IFNα刺激FMD-C1細(xì)胞的劑量依賴(lài)性見(jiàn)圖10-A。用4種濃度FMD-IFNα刺激FMD-C1細(xì)胞12 h后，F(xiàn)MD-C1的ISG轉(zhuǎn)錄水平有了較大提升，并且具有較明顯的劑量依賴(lài)性。Viperin、Mx1和ISG15在200 ng/mL處理組中的表達(dá)量顯著高于100 ng/mL處理組；400 ng/mL處理組的OAS、ISG15和ISG56表達(dá)量顯著高于200 ng/mL處理組（P＜0.05）。總體來(lái)看，400 ng/mL對(duì)FMD-C1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用最強(qiáng)。時(shí)間依賴(lài)性試驗(yàn)結(jié)果顯示FMD-IFNα對(duì)ISG轉(zhuǎn)錄的刺激主要集中于前6 h，在后面的18 h里，F(xiàn)MDIFNα對(duì)ISG轉(zhuǎn)錄的調(diào)控效果受到持續(xù)的限制，導(dǎo)致ISG mRNA量持續(xù)下降，具體結(jié)果見(jiàn)圖10-B。

圖10 FMD-IFNα調(diào)控ISG轉(zhuǎn)錄結(jié)果Fig. 10 Regulation results of FMD-IFNα on ISG transcription

2.5 林麝IFN-α對(duì)FMD-C1細(xì)胞增殖的抑制作用

使用CCK-8法對(duì)FMD-IFNα抑制FMD-C1細(xì)胞增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖11。FMD-IFNα對(duì)FMD-C1細(xì)胞的增殖抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性，100 ng/mL FMD-IFNα對(duì)FMD-C1細(xì)胞的增殖抑制效果顯著高于50 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05）；400 ng/mL FMD-IFNα對(duì)FMD-C1細(xì)胞的增殖抑制效果顯著高于200 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05），細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了最高的16.67%。

圖11 FMD-IFNα對(duì)FMD-C1細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 11 Inhibitory effect of FMD-IFNα on the proliferation of FMD-C1 cells

3 討論

隨著人工養(yǎng)麝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，林麝疾病防治研究也在深入進(jìn)行。目前，林麝糞便中已檢測(cè)出多種病毒，并且已有林麝感染病毒致死的報(bào)道［4，13-14］。因此，林麝病毒性疾病的防治對(duì)人工養(yǎng)麝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。IFN-α是 I型干擾素的一種，具有多個(gè)亞型，是目前研究最多的干擾素，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，如：各種肝炎、人乳頭瘤病毒、水泡性口炎等病毒病［15-17］。研究林麝IFN-α對(duì)于林麝病毒性疾病的防治具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。

本次試驗(yàn)克隆的9種FMD-IFNα亞型的核苷酸序列具有高度同源性；信號(hào)肽組成與反芻類(lèi)物種IFN-α相一致；半胱氨酸與脯氨酸位點(diǎn)均與已知哺乳動(dòng)物 IFN-α一致［18-21］。FMD-IFNα的二級(jí)結(jié)構(gòu)由緊密排列的α-螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這是 I型IFN都具有的相似的結(jié)構(gòu)。FMD-IFNα的三級(jí)結(jié)構(gòu)與牛和人IFNα高度相似。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明FMD-IFNα可以與IFN-α受體（IFNAR-1和IFNAR-2）結(jié)合。IFNAR-1與IFNAR-2是干擾素生物活性至關(guān)重要的受體。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示了FMD-IFNα與反芻亞目物種的近屬關(guān)系，同時(shí)9種FMD-IFNα單獨(dú)聚為一支，表現(xiàn)出一定的種屬特異性。為進(jìn)一步研究FMD-IFNα的活性，本次試驗(yàn)使用畢赤酵母表達(dá)體系完成了對(duì)FMD-IFNα的表達(dá)。

IFN-α具有強(qiáng)大的抗病毒作用，這個(gè)作用是通過(guò)調(diào)節(jié)數(shù)量龐大的IFN刺激基因（ISG）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。ISG編碼的眾多蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)建立起對(duì)病毒的廣譜抵抗?fàn)顟B(tài)［22］。本次試驗(yàn)檢測(cè)了FMD-C1細(xì)胞5個(gè)ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）轉(zhuǎn)錄水平的變化。OAS可以抑制病毒蛋白合成及病毒復(fù)制；Viperin能夠抑制病毒的出芽及釋放；Mx1可以抑制病毒核酸進(jìn)入胞內(nèi)；ISG15通過(guò)將靶蛋白ISG化修飾來(lái)調(diào)節(jié)病毒和宿主蛋白的功能，抑制病毒的復(fù)制、出芽、釋放；ISG56與其他家族蛋白以及數(shù)種RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，從而清除病毒［23］。試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)MD-IFNα能顯著提高FMD-C1細(xì)胞5個(gè)ISG的轉(zhuǎn)錄水平。400 ng/mL FMD-IFNα刺激FMD-C1細(xì)胞6 h使Viperin轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到了對(duì)照組的近3 000倍，Mx1、ISG15和ISG56的轉(zhuǎn)錄水平也是提高了100-300倍。

臨床研究表明，IFN治療期間，ISG的誘導(dǎo)水平差異很大，表達(dá)水平通常取決于時(shí)間，劑量和細(xì)胞類(lèi)型［24］。大劑量IFN-α作用后，可迅速發(fā)生IFN信號(hào)傳導(dǎo)并激活I(lǐng)SG轉(zhuǎn)錄，但I(xiàn)SG mRNA積累量的峰值都是出現(xiàn)在6 h之前，并于6 h之后快速下調(diào)［25-26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明FMD-IFNα上調(diào)FMD-C1細(xì)胞ISG轉(zhuǎn)錄水平作用具有劑量依賴(lài)性，并于前6 h時(shí)效果最強(qiáng)，與相關(guān)報(bào)道一致。ISG轉(zhuǎn)錄水平的快速下調(diào)是由多種機(jī)制促成的，除了相關(guān)受體的缺失，更主要的機(jī)制是產(chǎn)生了信號(hào)抑制因子，如：SOCS1、STAT1β 等［27-28］。SOCS1可 與 IFN-α 受 體 IFNAR1結(jié)合，從而阻斷STAT1的激活；STAT1β是STAT1的另一種剪接變體，可結(jié)合DNA但不能激活蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。只要IFN-α存在，就能使受體細(xì)胞脫敏持續(xù)存在。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道IFN-α可以抑制成纖維細(xì)胞增殖［29-30］。FMD-IFNα也能抑制FMD-C1細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴(lài)性，與陳君毅等［31］、于宏等［32］研究結(jié)果一致。IFN-α抑制細(xì)胞增殖是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期，并誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的［33-34］。IFN-α?xí)种萍?xì)胞由G0/G1期向S期的過(guò)渡，并促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞的凋亡［35］。目前已知的IFN-α阻滯G0/G1期細(xì)胞的機(jī)制包括調(diào)控p21基因的表達(dá)、抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2（Cdk2）活性、降低E2F轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性等［36］。此外，IFN-α?xí)七t細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，延長(zhǎng)細(xì)胞處于S期的時(shí)間［37］。Detjen等［38］研究表明IFN-α延長(zhǎng)細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期的作用與細(xì)胞周期蛋白B（Cyclin B）表達(dá)的抑制，細(xì)胞分裂周期基因2（Cdc2）蛋白活性的降低有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆9種林麝IFN-α基因序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，最后研究了IFN-α對(duì)FMD-C1細(xì)胞的ISG轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用和抗增殖作用，為進(jìn)一步研究林麝干擾素α的抗病毒作用和免疫調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。