序列變異對miR-378生物發生以及靶標關系的影響

張廷煥 郭宗義 柴捷 潘紅梅 張亮 陳磊 龍熙

（1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2. 內江豬研究所，內江 641000；3. 農業農村部養豬科學重點實驗室，重慶 402460）

microRNA（miRNAs）是一類長度約22 nt的內源性非編碼RNA，它的主要功能是作為一種負調控因子控制基因轉錄后的表達水平，所以miRNAs對幾乎所有的生物學過程都有廣泛的調節作用［1-2］。在動物中，miRNAs具有非常典型的生物發生過程，首先是由RNA聚合酶II介導的miRNAs位點的轉錄，在細胞核內產生miRNAs初級轉錄物（primiRNAs）［3］；其次，pri-miRNAs經 Drosha 和 DGCR8的復合酶剪切成具有發夾結構的miRNAs前體轉錄本（pre-miRNAs）［4-5］；最后，pre-miRNAs被轉運至細胞質中由Dicer酶處理成具有雙鏈結構的成熟miRNAs，其中一條鏈與AGO蛋白結合形成RNA誘導沉默復合物（RISC）發揮生物學作用，而另一條鏈被快速釋放或降解［6-7］。

可見，miRNAs生物發生過程受到了多種酶類的精確控制，所以miRNA的任何序列變異都有可能影響其加工過程，進而打破基因的調控平衡，造成機體生物學紊亂［8］。而事實上，已有大量研究報道了miRNAs的突變對其發生、功能等的影響，甚至一些突變直接導致疾病的發生。例如，pre-miR-128b的+13位點發生了A＞G的突變（+13/A＞G），降低了pri-miR-128b的加工效率和成熟體miR-128b的表達［9］；成熟體miR-125a中一個單堿基突變影響了pri-miR-125a向pre-miR-125a的加工，降低了miR-125a表達水平，而且這個突變與多種癌癥相關［10］；pri-miR-126的+24/A＞G突變阻礙了pre-miR-126的生成，從而使miR-126的表達量下降［11］。而種子序列是miRNA與靶基因mRNA結合發揮作用的關鍵位點，在物種間相對保守［12］，它的突變則可能引起miRNAs靶標關系的變化，喪失對靶基因的調控作用。比如，miR-96種子序列存在G＞A和C＞A的變異，突變使得原本靶基因的表達水平提升，導致內耳毛細胞發育異常而造成非綜合征型耳聾［13］。

miR-378在體內廣泛表達，對多個組織的發育起著十分重要的作用。在脂肪組織中，miR-378能促進脂肪分化［14］，影響脂質沉積［15］，同時還能促進棕色脂肪產熱［16］；在肌肉組織中，miR-378能控制骨骼肌分化［17］、心臟的重塑［18］以及心肌細胞的存活［19］；在肝臟組織中，miR-378能調控胰島素信號，進而調節葡萄糖和脂質穩態［20］；此外，miR-378還在成骨分化、細胞色素調控、黃體細胞凋亡、卵巢雌激素產生以及不同癌細胞的發生等［21-22］過程都扮演著關鍵角色。目前miR-378已經具有相當程度的研究基礎，但對于miR-378序列變異研究較少。本文比對不同豬種miR-378-3p堿基序列，發現榮昌豬和內江豬的群體中擁有2個相同的變異位點；利用結構預測軟件，確定這兩個位點的突變影響了miR-378的二級結構和自由能；構建miR-378表達載體驗證了突變對miR-378表達水平影響；隨后解析了突變對miR-378靶標關系的作用。本文明確了豬miR-378突變對其表達、生物加工過程以及靶基因選擇的影響，為miR-378多態性研究奠定了一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

榮昌豬和內江豬血液樣品來自重慶市種豬場；人胚胎腎細胞（HEK293）購自北京協和細胞資源中心；DNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶、T4連接酶和限制性內切酶均購自NEB公司；試劑大腸桿菌感受態細胞TOP10購自博邁德生物公司；蛋白酶K、質粒pSilencer 3.1-H1 neo、GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒均購自Promega公司；miScript II RT試劑盒、miScript SYBR Green PCR 試劑盒購自QIAGEN公司；質粒提取試劑盒來自Omega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；生物素（Bi）標記的miRNA由銳博公司合成；瓊脂糖、DNA marker購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-378基因的擴增 從Ensembl數據庫（http：//www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）中下載豬pri-miR-378附近的基因組序列，利用Primer 5.0軟件設計正反向引物（表1）。以榮昌豬和內江豬的DNA為模板，采用 Q5超保真DNA聚合酶對pri-miR-378進行PCR擴增，共50 μL PCR反應體系 ：5×reaction buffer 10 μL ；MgCl2（15 mmol）1.5 μL ；dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL ；forward primers（10 μmol/L）2.5 μL ；Reverse primers（10 μmol/L）2.5 μL ；Template DNA（50 ng/μL）2.0 μL ；Q5 highfidelity DNA polymerase 0.5 μL ；加水至 50 μL。采用凝膠電泳確定擴增片段的單一性和大小的正確性，再對PCR產物進行測序，獲得pri-miR-378在榮昌豬和內江豬中的堿基序列。

表1 pri-miR-378 PCR擴增引物Table 1 PCR primers of pri-miR-378

1.2.2 miR-378二級結構及其自由能預測 采用RNAfold軟件（http：//rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNA WebSuite/RNAfold.cgi）對pre-miR-378突變前后的二級結構及其自由能進行預測。

1.2.3 miR-378表達載體的構建 利用1.2.1中擴增得到的兩種不同基因型的pri-miR-378目的片段（primiR-378/AA和pri-miR-378/GG），通過膠回收、酶切、純化后，再利用T4連接酶分別與酶切線性化的質粒pSilencer 3.1-H1 neo進行連接，分別生成含有primiR-378/AA和pri-miR-378/GG的表達載體pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG，通過測序確定其序列的正確性。

1.2.4 miR-378、pri-miR-378、pre-miR-378表達水平驗證 將上述1.2.3構建的表達載體pS-miR-378/AA、pS-miR-378/GG以及陰性對照pSilencer 3.1-H1 neo（pS-Control）分別轉染至HEK293細胞中，每組設定3個重復，轉染48 h后回收細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA。利用Primer 5.0設計的定量的引物（表2）分別對miR-378/AA、miR-378/GG及其對應的初級前體與前體轉錄本進行表達量分析，Neomycin作為內參基因。其中miR-378成熟體反應體系：QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（2×）5 μL，miScript Universal Primer（10×）1 μL，miScript Primer Assay（10×）1 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 2 μL；反應 程 序 ：95℃ 15 min，95℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃30 s，40個循環。Pri-miR-378和Pre-miR-378的反應體系和程序參考1.2.6。

表2 miR-378 RT-PCR引物Table 2 RT-PCR primers of miR-378

1.2.5 miR-378靶基因預測以及功能富集分析 利用在線軟件TargetScan 5.1（http：//www.targetscan.org/vert_50/seedmatch.html） 和 TargetRank（http：//holly wood.mit.edu/targetrank/）分別對成熟體miR-378不同基因型（miR-378/A和miR-378/G）進行靶基因預測；然后再利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）軟件對靶基因進行功能富集分析。

1.2.6 miR-378靶標關系驗證 采用microRNA pulldown技術對候選靶基因（GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10）進行驗證。首先合成了3種不同的生物素（Bi）標記的miRNA，即實驗組Bi-miR-378/A、Bi-miR-378/G以及陰性對照Bi-Control。將3種BimiRNA分別轉染至HEK293細胞中，miRNA能與靶基因mRNA結合，培養48 h后，將細胞裂解加入磁珠，充分混勻使磁珠與Bi-miRNA相結合，最終形成磁珠miRNA-mRNA的復合物，再利用磁力架將復合物捕獲，再對其進行清洗、洗脫釋放mRNA，隨后利用反轉錄和RT-PCR檢測GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10 4個靶基因的mRNA富集程度，10 μL 反應體系 ：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH20 3.5 μL。反應程序 ：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個循環，采用 2-△△Ct方法計算基因表達量。RT-PCR所用引物如表3。

表3 miR-378靶基因RT-PCR擴增引物Table 3 RT-PCR primers of miR-378 targets

1.2.7 統計分析 使用Excel 2013進行試驗數據整理，用SPSS軟件中的單因素方差分析進行差異顯著分析，使用Publisher2013作圖。

2 結果

2.1 miR-378序列變異分析

為了探索不同豬種miR-378序列的差異性，我們分別擴增出8頭榮昌豬和8頭內江豬的miR-378片段（圖1-A），通過序列比對發現，在榮昌豬和內江豬群體內miR-378前體（pre-miR-378）同時存在兩個相同位點的A＞G單堿基突變，分別位于其+49和+68位，定義為miR-378/AA型和miR-378/GG型（圖1-B）。

圖1 豬miR-378的擴增和測序Fig.1 Amplification and sequencing of porcine miR-378

隨后利用RNAfold對miR-378/AA和miR-378/GG的前體結構和自由能進行了預測，發現兩個突變直接改變了pre-miR-378的二級結構，+49/A＞G突變使得莖結構上的凸環顯著變小，而+68/A＞G突變使得A與U連接的氫鍵斷裂，堿基懸掛在末端（圖2-A）；同時突變還改變了pre-miR-378A的自由能分布，特別是第20位和第50位堿基附近的熵值GG型明顯高于AA型（圖2-B）。

圖2 miR-378結構和能量預測Fig.2 Structure and energy prediction of miR-378

2.2 序列變異對miR-378表達水平的影響

由于上述突變導致了miR-378的自由能和結構發生了變化，為了確定它們是否會影響miR-378的表達水平，在榮昌豬群體中擴增得到pri-miR-378/AA和pri-miR-378/GG片段（圖3-A），分別插入pSilencer 3.1質粒中（圖3-B），構建兩種初級轉錄本的過表達載體（pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG），同時通過測序驗證了插入片段的序列正確性（圖3-C）。

圖3 miR-378過表達載體的構建Fig.3 Construction of miR-378 overexpression vector

首先，發現成熟體miR-378的表達量在pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG兩組間出現了顯著差異且GG型高于AA型（約2.3倍，P＜0.01），同時二者均高于pS-Control組（圖4-A），說明序列變異的確改變了miR-378的表達。為了進一步驗證突變對miR-378生物發生過程中哪一步產生影響，設計了特殊的引物對pri-miR-378和pre-miR-378的表達進行了鑒定（圖4-B，表2）。結果發現AA型和GG型的pri-miR-378表達水平沒有差異（P＞0.05）（圖4-C），但是在pri-miR-378和pre-miR-378兩者的表達總量上AA型要顯著降低，約占GG型的64%（P＜0.01）（圖4-D），而這兩種轉錄本在pS-Control組幾乎不表達。數據表明序列變異并沒有改變pri-miR-378的轉錄，然而卻改變了pri-miR-378到pre-miR-378的加工過程。

圖4 miR-378各級產物表達量分析Fig.4 Analysis of miR-378 products in expressions

2.3 序列變異對miR-378靶標關系的影響

其中，上述發現的+49位A＞G的突變剛好位于豬miR-378成熟體種子序列+5位（圖1-B），屬于miRNAs與靶基因結合發揮作用的功能位點（種子序列2-8位）。miR-378成熟體序列以及其種子序列在多個物種中（豬、人、大鼠、小鼠、牛和羊等）具有高度保守，但人和豬miR-378種子序列+5位都發生了A＞G突變（圖5-A）。為了探索該變異對miR-378靶標關系的影響，利用TargetScan和TargetRank兩款軟件分別對miR-378/A（+5/A）和miR-378/G（+5/G）進行靶基因預測，其中TargetScan分別得到120個和184個靶基因，而TargetRank分別得到355個和726個靶基因，可見不同軟件得到的靶基因預測結果相差較大。為了得到可信度較高的靶標關系，將這4組靶基因進行了多重比對，如圖5-B、5-C所示，+5/A＞G突變失去的靶基因（Lost_targets）38個，主要顯著富集在組織組織形態、RNA剪切調控、Wnt信號通路上；因突變獲得的靶基因108個（Gained_targets），顯著富集在與組織組織形態、RNA剪切調控、BMP反應、細胞分化、大腦發育、肌肉發育等相關的通路上；此外突變前后共有的靶基因（Shared_targets）4個（表4）。

圖5 miR-378靶標關系和功能預測Fig.5 Target relationship and function prediction of miR-378

為了進一步驗證突變對于miR-378靶標關系的影響，從表4中挑選了4個候選靶基因：Runx1t1、Galnt3、GDF6和 RAB10，運用 microRNA pull-down技術對miR-378靶標關系進行了檢驗。將帶生物素標記（Bi）的miR-378/A、miR-378/G成熟體以及陰性對照（Bi-Control）分別轉染至HEK293細胞48 h后，運用磁珠捕獲、清洗miRNA與靶基因mRNA形成的復合物，隨后洗脫、反轉錄，再利用RT-PCR對上述4個候選靶基因進行富集分析。結果發現，GDF6的富集程度在Bi-miR-378/A和Bi-Control 沒有差異，在Bi-miR-378/G組顯著上升（P＜0.01），說明GDF6的確是+5/A＞G突變后獲得的靶基因（圖6-A）；只有Bi-miR-378/A組的RAB10的富集程度顯著高于對照組（P＜0.01），Bi-miR-378/G并沒有出現差異現象，證實了RAB10是突變后失去的靶基因（圖6-B）；而Runx1t1和Galnt3在Bi-miR-378/A和Bi-miR-378/G組中的富集程度均顯著高于Bi-Control（P＜0.01），證明了突變并未改變Runx1t1和Galnt3與miR-378的靶標關系（圖6-C、D）。上述結果表明miR-378種子序列的+5/A＞G序列變異的確會改變靶標關系，但也存在一些靶基因不會受此突變的影響。

表4 miR-378的靶基因列表Table 4 Target list of miR-378

圖6 miR-378靶基因的富集程度驗證Fig.6 Verification of enrichment degree of miR-378 targets

3 討論

序列變異是基因組DNA水平發生的可遺傳突變，是生物多樣性的基礎，是物種進化、分子育種、優良性狀選育、人類疾病等研究最為寶貴的遺傳資源。本文在內江豬和榮昌豬pre-miR-378序列中發現了兩個突變，分別是+49/A＞G和+68/A＞G。其中+68/A＞G的突變是第一次被發現，且僅存在于內江豬和榮昌豬群體中。+49/A＞G的突變已在多個研究中被報道［18，23］，在不同豬種進化過程中該位點受到了不同程度的人工選擇，本文還發現人在相同位點也出現了A＞G的突變，進一步說明了該位點的重要性。突變往往會導致miRNAs二級結構和自由能的變化，然而本文中的兩個位點的變化卻大不相同。+49/A＞G位于pre-miR-378的莖環上，與pre-miR-126［11］和 pre-miR-15b［24］莖環上的突變改變其二級結構和自由能一樣，+49/A＞G突變使得堿基通過氫鍵重新配對，莖環變小，結構更緊密，自由能下降，特別是莖環上+20和+50位附近堿基的熵值明顯降低；而+68/A＞G是首次被發現位于premiRNAs末端的突變，是pri-miR-378到pre- miR-378加工過程中的剪切位點，雖然未改變該位點的自由能，但它使得pre-miR-378末端氫鍵斷裂，堿基游離，結構變得疏松。

此外，序列變異還能引起miRNAs表達量的變化，本文發現+49/A＞G和+68/A＞G改變了premiR-378和成熟體miR-378的表達水平，而GG型均顯著高于AA型，這與突變增加了miR-10a［25］、miR-510［8］和 miR-34a［26］等表達量一致，但也有大量研究報道突變降低miRNA表達，比如miR-128b［9］、miR-15b［24］和 miR-890［27］等，暗示 miRNA不同位點的突變對其表達變化的影響不盡相同；但pri-miR-378的表達水平并未發生改變，說明本文中的兩個突變不影響miR-378初級本的正常轉錄，只是改變了它到pre-miR-378的生物發生過程。同時與miR-125a的 G＞T突變影響與DGCR8的結合一樣［10］，本文中pre-miR-378的+49突變位點正好位于DGCR8與pri-miRNA結合區域，+49/A＞G突變后引起的自由能下降使得其二級結構趨于穩定，更加有利于DGCR8的結合效率；同時+68位點位于premiR-378的末端，屬于Drosha /DGCR8復合酶的剪切位點，而該位點A＞G突變后雖然自由能未改變，但氫鍵斷裂結構疏松更加有利于復合酶的剪切效率。所以本文+49和+68的 A＞G突變后對pri-miR-378到pre-miR-378的加工過程中酶類的結合和剪切效率都有促進作用，從而上調了pre-miR-378的總量，提升了成熟體miR-378的表達水平。除此之外，本文還發現相對于對照組（pS-Control），pri-miR-378、pre-miR-378的相對表達量與miR-378之間呈現數量級的差異，這是因為HEK293細胞本身具有成熟體miR-378的表達，而并沒有pri-miR-378、premiR-378的轉錄本。

miRNAs最主要的作用方式是通過其5′的2-8位核苷酸序列（種子序列）與靶基因mRNA的3′UTR區序列相結合，但當種子序列發生突變時，會造成miRNAs靶基因出現缺失或獲得的情況，比如種子序列突變后使miR-4293失去了90%以上的靶基因，同時使miR-518d-3p、miR-3622a-5p獲得了大量的靶基因［27］。本文發現 miR-378的 +49/A＞G 正好位于其種子序列第5位（+5/A＞G），其中失去的靶基因38個而獲得的靶基因108個。然種子序列的突變所引起的靶標關系變化，必然會導致機體生物學過程的失衡，甚至引起疾病的發生。miR-184種子序列的突變影響了與INPPL1、ITGB4的靶標關系，從而造成了白內障相關疾病［28］。miR-499種子序列改變了與靶基因Pdcd4的識別，造成了某些心臟疾病的發生［29］。而本文發現+5/A＞G突變后miR-378獲得的和失去的靶基因所富集的生物學通路也發生了變化，都單獨富集在了一些非常重要的通路上。例如，獲得的靶基因在BMP應答通路上顯著富集，該通路具有一類結構相似且高度保守的功能蛋白BMPs，它們在動物體內廣泛表達，不僅能促進間充質細胞定向分化成成骨細胞調節骨骼發育，還能對脂肪、肝臟、腎臟以及神經系統等發育起重要作用［30-31］。本文通過microRNA pull-down實驗也證實了BMPs的成員GDF6（也叫作BMP13）［32］的確是miR-378突變后獲得的靶標關系。而失去的靶基因顯著富集在WNT信號通路上，此通路在物種進化過程中高度保守，在動物胚胎早期發育、器官形成、組織再生和其他生物過程都具有至關重要的作用［33-34］，該通路上的關鍵基因RAB10也被證實是miR-378突變后失去的靶標關系。除此之外，也存在一些靶基因并不會受到種子序列突變的影響，本文驗證得到了兩個未發生變化的靶標關系-Runx1t1和Galnt3，這可能與miRNAs種子序列和mRNA的3′UTR區完全配對和部分配對的結合方式相關，這兩種方式miRNAs負責的調控機制不同，前者miRNAs誘導mRNA降解，而后者則是抑制mRNA的翻譯［35-36］。

4 結論

本文發現的兩個序列變異改變了miR-378的結構和自由能，影響了miR-378生物發生過程，提升了miR-378的表達，同時造成了靶標關系以及生物學功能的變化。