紫花苜蓿粗灰分與礦質元素含量QTL定位分析

楊習江， 楊昌福， 蔣學乾， 張 帆， 何 飛， 楊青川， 康俊梅

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所， 北京 100089)

植物體內鉀(Potassium，K)、鈣(Calcium，Ca)、鎂(Magnesium，Mg)、磷(Phosphorus，P)等礦質元素是促進植物生長發育的重要營養元素[1]，也是牧草礦質營養的重要組成部分。牧草作為草食動物的重要食物來源，其體內的礦質元素對動物的營養調節代謝[2]發揮重要的作用。K是植物中最豐富的陽離子，參與植物滲透壓、細胞膜電位、pH的調節過程[3]，也參與蛋白質合成和光合作用過程中酶的活化[4]，同時也能參與動物的葡萄糖轉運[5]。有研究發現，施K可提高紫花苜蓿(Medicagosativa)的碳水化合物含量，并調控其在苜蓿各器官中的合理分配，進而增強苜蓿對薊馬(Thripidae)的耐害性[6]。Ca是生物體中普遍存在的第二信使，它參與各種細胞過程，調控植物的發育，以及響應生物和非生物脅迫響應[7]，比如對植物干旱、傷害和熱脅迫的快速反應，從而增強植物的免疫力[8]。施加適宜濃度的CaCl2可以緩解干旱對苜蓿幼苗造成的傷害[9]。Ca也是動物骨骼和牙齒的主要成分。Mg是葉綠素的中心元素，是一系列固碳相關酶的輔助因子。因此，Mg與植物光合作用和光合產物的運輸密切相關，是植物生長發育的重要元素[10]。在動物中，Mg對肌肉再生也有很重要的作用[11]。P與植物產量調控密切相關，有研究報道當植物對P的攝入不足時會使植株產量降低10%～15%[12]，適宜施P量可有效提高苜蓿種子莢果數、結莢率和種子產量[13]。動物體內P是必不可少的營養元素，是細胞膜、三磷酸腺苷(ATP)、骨骼和牙齒的主要構成成份，主要參與能量代謝，脂類物質的吸收和轉運，以及動物蛋白的形成等生物學功能。粗灰分含量是衡量飼料產品和飼料原料中營養成分的重要指標之一，也是飼料產品必須測定的營養指標之一，粗灰分測定對指導飼料及飼料原料的加工都具有重要意義[14]。因此，研究牧草體內礦物質元素的遺傳信息不僅對揭示其自身的生物學功能奠定理論基礎，而且對通過牧草的遺傳改良為草食動物提供營養元素具有重要意義。

植物體內礦物質元素的傳統測定方法為化學測定法，該方法耗時長、成本昂貴。近紅外光譜技術(Near infrared spectrum instrument，NIRS)具有無損、快速等優點，近年來已被廣泛應用于植物的品質相關性狀的測定[15-17]。由于植物的大多數品質相關性狀，以及礦質元素(如K，Ca，Mg，P等)含量都是由多個基因調控的數量性狀，既受環境的影響，也受環境和基因型互作的影響[18]。針對數量性狀位點的研究，利用連鎖分析方法能夠有效地鑒定出控制這些復雜性狀的數量性狀基因座(Quantitative trait loci,QTL)。到目前為止，在很多植物中開展了關于礦質元素的QTL研究，如水稻(Oryzasativa)[19-20]，玉米(Zeamays)[21-22]，小麥(Triticumaestivum)[23-24]，大豆(Glycinemax)[25]和花生(Arachishypogaea)[26]。

紫花苜蓿是世界上種植面積最大的多年生豆科牧草，由于產量高、品質優、營養價值高，具有豐富的礦物質元素等特點，被譽為“牧草之王”[27-28]。苜蓿的品質相關性狀一直是育種家關注的研究重點，國內外對于苜蓿品質相關性狀已經開展了大量的研究，主要集中在蛋白質、次生代謝物、纖維素、木質素等方面[18,29-30]，與礦質元素相關的研究鮮有報道，只有一些初步的關聯分析[18]和基因組預測[30]。本研究以紫花苜蓿F1雜交群體為材料，采用近紅外光譜技術分析法對苜蓿的粗灰分及礦質元素含量進行測定，結合原有的高密度遺傳圖譜，初步檢測與粗灰分，K，Ca，Mg，P品質性狀相關的QTL位點，找到一些穩定遺傳的分子標記，以期為挖掘調控苜蓿礦質元素相關候選基因奠定基礎，同時緊密連鎖的分子標記可用于分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)育種對苜蓿進行遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于河北省廊坊市中國農業科學院(萬莊) 國際農業高新技術產業園基地(39.59°N，116.59°E)，屬于暖溫帶大陸性季風氣候，四季分明，冬寒夏熱，秋涼春旱。年均氣溫11.9℃左右，年均降水量554.9 mm，年均日照時數2 660 h左右，無霜期183 d。供試土壤質地為中性土壤，有機質含量為1.69%，pH值為7.37。

1.2 試驗材料

本試驗以低產早熟紫花苜蓿為父本(P1，CF000735)，以高產晚熟紫花苜蓿為母本(P2，CF032020)，且在礦質元素含量上有顯著差異的父母本進行種內雜交，創建了包含392個單株的F1作圖群體。F1群體種子于2015年在溫室培養。通過扦插獲得親本和子代的無性繁殖株系，在2016年早春，將雙親和F1群體移栽到田間種植，設置3個重復，行距1 m，株距0.8 m。扦插后生長至初花期前刈割兩次，確保植株的生長一致性，之后再進行植株表型的測定。

1.3 表型性狀測定與統計分析

分別于2016，2019和2020年的初花期刈割第一茬植株。初花期即單株觀察到第一朵小花的開放時期，時間大概在每年5月，不同單株刈割時間不同。然后將樣品置于鼓風干燥箱內，60℃條件下烘24 h至絕干。用粉碎機研磨，過1 mm篩網后，取150 g粉樣進行標號裝袋。隨后，采用近紅外反射光譜儀(FOSNIRS1650)對苜蓿中的粗灰分(Ash)，K，Ca，Mg和P含量進行測定。2017和2018年由于人員不足，無法完成大規模粉碎及測定工作，因此未收集到表型數據。在測定前，對儀器模型進行校正，用10%的樣品進行化學法測定，與近紅外光譜儀器測定數據進行比較和校準，誤差在10%以內。測定數據用Microsoft Excel 2019軟件進行整理，用SAS 9.4軟件進行基本統計分析和相關性分析。

1.4 遺傳圖譜與QTL定位分析

利用本實驗室前期已構建好的紫花苜蓿的遺傳連鎖圖譜[31]為基礎，進行粗灰分與4種礦質元素的QTL定位。構建好的父本連鎖圖譜包含32個連鎖群，944個單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)標記，圖譜總長4 088.70 cM，標記間的平均遺傳距離4.33 cM。母本連鎖圖譜包含32個連鎖群， 2 874個SNP標記，圖譜總長4 229.15 cM，標記間的平均遺傳距離1.50 cM。使用QTL IciMapping軟件，首先進行遺傳力和最佳線性無偏差預測值(Best linear unbiased prediction，BLUP)的計算；之后利用BIP功能，選擇ICIM-ADD模型，以LOD > 3為閾值，進行QTL檢測(QTL命名遵循McCouch等[32]原則);最后用Mapchart 2.3軟件繪制QTL定位圖。

2 結果與分析

2.1 粗灰分與礦質元素表型分析

對F1群體及親本在3年測定的粗灰分與4種礦質元素性狀表型值進行統計分析(表1)，發現除去2016年的Ash,K和P含量，以及2020年P含量父母本之間未表現出顯著性差異，在其他環境下父本性狀均優于母本，且存在顯著性差異(P<0.05)。F1群體中，粗灰分與4種礦質元素K，Ca，Mg，P含量分別占干物質含量的7.0%，2.0%，1.5%，0.3%和0.3%，且從變異幅度看，其分布范圍均在雙親差異的范圍之外，存在廣泛變異(表1)。同時，粗灰分與4種礦質元素含量性狀的遺傳力均大于0.50，具有較高的遺傳力，表明受遺傳特性的影響較大。另外，除2019年測定的Ash，K，Mg含量峰度和偏度絕對值偏差較大外，其余性狀在群體中分布的峰度和偏度絕對值均小于1(表1)，其表型頻率分布均表現為正態或近似正態的連續分布，且存在雙向超親分離現象，符合QTL定位分析。

表1 粗灰分和4種礦質元素在F1群體中的統計Table 1 Statistics of ash and four mineral elements in F1population

2.2 粗灰分與礦質元素含量間的相關性分析

對F1群體粗灰分與4種礦質元素含量間相關性進行分析(表2)，發現除Mg含量和Ca含量相關性較低外(P<0.05)，其余性狀間都呈極顯著正或負相關關系(P<0.001)(表2)。Ash含量與Mg含量極顯著正相關(P<0.001)(r=0.608)，卻與K，Ca，P含量極顯著負相關(P<0.001)。礦質元素之間，除Mg含量與K和Ca含量呈負相關關系外(P<0.05)，其余K含量與Ca和P含量呈極顯著正相關關系(P<0.001)，P含量與Ca和Mg含量也呈極顯著正相關關系(P<0.001)。

表2 F1群體5個品質相關性狀間的Pearson相關性分析Table 2 Pearson correlation analysis for five quality-related traits in F1 populations

2.3 QTL定位分析

基于前期構建的高密度遺傳圖譜，3個環境中共檢測出63個與粗灰分和4種礦質元素,含量相關QTL(表3，圖1，圖2)，分布于2C,3C,4B,4D,6B,6D,7D,8B染色體的不同位置，貢獻率介于3.04%～24.83%之間。經鑒定與粗灰分相關的QTL共10個，其中3個位于父本，7個位于母本，貢獻率介于2.88%～5.10%之間。母本中qAsh-8B-1和qAsh-8B-2屬于重復定位QTL，位于8B染色體125 cM處，側翼標記區間為TP65937-TP6047，貢獻率分別為5.06%和4.71%。3個環境中共鑒定出10個與K含量相關的QTL，均來源于母本連鎖群，解釋的表型變異為3.10%～7.25%，其中于2020年環境中檢測到表型變異最大的QTL(qK-2C)，位于2C染色體TP77362-TP23382標記區間內，可解釋7.25%的表型變異。共檢測到15個與Ca含量相關的QTL，3個位于父本，12個位于母本，貢獻率介于3.00%～6.56%之間。重復定位的QTL共有6個：其中qCa-3C-1和qCa-3C-2位于父本3C染色體TP29222-TP47945標記區間內，分別可解釋3.95%和3.04%的表型變異；qCa-6B-1和qCa-6B-2位于母本6B染色體TP2660-TP96620標記區間內，貢獻率分別為3.00%和3.72%；qCa-6D-1和qCa-6D-2位于母本6D染色體TP8104-TP24250標記區間內，分別可解釋6.14%和3.64%的表型變異。所有重復定位QTL的加性效應值均為負(Add < 0)，表明影響Ca含量增加的位點均來自于父本。三個環境下與Mg相關的QTL共12個，可解釋表型變異為3.42%～12.77%。其中有3個QTL的貢獻率大于10%，分別是qMg-6D-2，qMg-7D，qMg-8B，貢獻率分別為12.77%，10.00%，10.97%。此外，16個與P含量相關QTL被鑒定，貢獻率介于2.50%～29.85%。其中有7個QTL貢獻率大于10%，其中qP-6D-1，qP-6D-2，qP-6D-3三個位于母本6D染色體，貢獻率分別為21.56%，29.85%，11.12%；qP-7D-2，qP-7D-3，qP-7D-4三個位于父本7D染色體，分別可解釋11.84%，20.77%，24.83%的表型變異；qP-4D位于父本4D染色體，貢獻率為10.11%。

表3 紫花苜蓿F1群體五個品質性狀的QTL定位結果Table 3 QTL analysis results of five quality traits in F1 population of alfalfa

續表3

圖2 苜蓿5種品質性狀QTL在母本遺傳連鎖群上的分布情況Fig.2 Distribution of QTLs for five quality traits on genetic map of maternal parent in alfalfa

此外，鑒定了3個共定位區間，其中qP-2C和qK-2C共定位于母本2C染色體60 cM處，分別解釋7.53%和7.25%的表型變異；qP-3A和qMg-3A共定位于母本3A染色體上67.5～69.5cM區間，貢獻率分別為5.86%和7.39%；qP-6D-3和qMg-6D-2共定位于母本6D染色體上38.5～40.5 cM區間，貢獻率分別為11.12%和12.77%。

3 討論

對苜蓿粗灰分與礦質元素含量測定數據分析發現，粗灰分與4種礦質元素K，Ca，Mg，P含量分別占干物質含量的7%，2%，1.5%，0.3%和0.3%，與以往關于苜蓿品質相關性狀含量測定的結果一致[18]。考慮到各個性狀受到一因多效性或多個基因相互作用的影響[33]，對粗灰分及4種礦質元素進行了相關性分析。結果顯示,粗灰分含量與K，Ca，Mg，P含量均存在顯著的相關性，這與礦質元素是粗灰分的主要組分有直接關系。此外，研究發現Mg含量與K，Ca含量都呈顯著負相關關系，K含量卻與Ca含量為顯著正相關關系，這可能是因為K，Ca，Mg參與了離子轉運載體的競爭，3者之間存在拮抗作用所造成的[34-36]。

QTL的多效性指同一區間檢測到的QTL同時參與幾個性狀的調控，這種情況在動植物中都普遍存在[37-38]，且此類與多個性狀關聯的標記在今后的分子標記輔助選擇上將會更有效地用于改善植株的多個性狀。本研究的結果也證實了多效應QTL的存在。在母本2C連鎖群上，qP-2C和qK-2C都定位于60 cM處，分別解釋了7.53%和7.25%的表型變異，表明TP77362-TP23382標記區間內可能存在一個QTL與P和K含量均有相關性；在母本3A 和6D染色體上區間67.5～69.5 cM和38.5～40.5 cM處，存在兩組與P和Mg含量相關的多效應QTL，分別為qP-3A和qMg-3A，qP-6D-3和qMg-6D-2，解釋表型變異較高，這些被定位在相同或相鄰區間的QTL與表型性狀間的相關性具有高度一致性。

此外，本試驗檢測到一些成簇分布的QTL，位于母本6D染色體上的成簇QTL有9個，集中分布于21～40 cM區間，其中與K含量相關的有1個，與Ca含量相關的有3個，與Mg含量相關的有2個，與P含量相關的有3個；位于父本7D染色體上的成簇QTL有6個，集中分布于21～67 cM區間，其中與Ash含量相關的有1個，與P含量相關的有4個，與Mg含量相關的有1個。成簇QTL產生的原因可能有兩點：一是連鎖群本身比其他連鎖群長度短，標記密度大(分別為0.50 cM和1.64 cM)，所以更容易檢測出QTL；二是由于一因多效或微效基因緊密連鎖于同一區間或基因重疊[39]，使相關性狀的QTL通常定位于同一連鎖群上相同或者相近區域。這些QTL能在不同環境或遺傳背景下，在不同性狀被檢測到，說明其表達具有一定的穩定、可靠性，將對苜蓿礦質元素相關分子標記研究具有重要意義。隨著紫花苜蓿基因組的破譯[40-41]，本研究中檢測出的多效應QTL和成簇分布的QTL區間將在今后研究中得到進一步驗證，通過鑒定緊密連鎖的分子標記，將為苜蓿分子標記輔助選擇育種提供重要的標記。

4 結論

本研究共檢測到63個與粗灰分，K，Ca，Mg，P含量相關的QTL，其中在父本7D染色體和母本6D染色體上存在QTL富集區域，分別檢測出6個和9個QTL，且貢獻率較高，今后如果對這些遺傳區域進行深入研究，挖掘與主效QTL緊密連鎖的分子標記，可為利用分子標記輔助選擇育種培育更豐富礦質元素的苜蓿新品種提供理論指導。