PD-1抗體對肥胖相關代謝紊亂的影響

吳玉呈，張青青

泰州市人民醫院心內科1、內分泌科2，江蘇 泰州 225300

近年來，肥胖的發病率在全球范圍內迅速增加，它與糖尿病、心腦血管疾病以及感染和腫瘤的發生都有著密切的關聯，給人類社會造成了巨大的經濟、心理負擔。目前研究已經證實肥胖所致的代謝紊亂及胰島素抵抗是上述并發癥產生和發展的中心環節，而肥胖狀態下內臟脂肪組織中的代謝紊亂及慢性炎癥反應則被認為是其導致胰素抵抗的重要病理生理機制[1]。目前有研究認為，肥胖患者體內脂肪組織的M1型巨噬細胞極化促進脂肪組織慢性炎癥，從而導致胰島素抵抗及糖代謝紊亂[2]。此外，通過特異性敲除脂肪細胞的MHC-Ⅱ分子來增加脂肪組織中Treg 細胞，可以在不影響小鼠體質量的情況下減輕肥胖引起的脂肪組織炎癥和代謝紊亂[3-4]。程序性死亡受體-1(PD-1)及其配體(PDL)具有負性調節的協同刺激信號，PD-1/PD-L1信號通路在調節代謝方面具有重要作用[5]。本研究組前期研究顯示肥胖患者的相關代謝指標水平顯著高于正常對照組，外周血PD-1/PD-L1 水平高于正常對照組。因此推測PD1/PDL1對肥胖患者的代謝有一定的調節作用。本研究旨在探討PD-1 對肥胖相關代謝紊亂的影響，為PD-1/PD-L1 通路治療肥胖相關代謝紊亂提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只6周齡C57BL/6小鼠購自揚州大學比較醫學中心，其中10只為正常小鼠(20～25 g，普通飼料)，20 只為肥胖小鼠(大于30 g，高脂飼料)。全部小鼠飼養于南京醫科大學附屬南京醫院實驗動物中心，環境溫度為(20±2)℃；空氣濕度50%～60%，小鼠自由飲水取食，12 h晝夜節律，及時清掃鼠籠及更換墊料。所有動物實驗方法均經南京醫科大學附屬南京醫院機構倫理委員會批準(1905292號)。

1.2 實驗方法 將20 只肥胖小鼠隨機分為肥胖組和肥胖+PD-1 組，每組10 只，再取10只普通小鼠作為對照組。對照組予以普通飲食及安慰劑注射，肥胖組予以高脂飲食及安慰劑注射，肥胖+PD-1組采用高脂飲食及PD-1 抗體腹腔注射，200 μg/只，間隔7 d 給予一次，共行4次治療。

1.3 觀察指標與檢測方法 4周后采用全自動生化分析儀測定三組小鼠的空腹血糖(FPG)、胰島素水平(Fins)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)水平。肝臟甘油三酯含量檢測采用南京建成生物科技有限公司的甘油三酯測定試劑盒(酶標儀比色法)進行檢測。采用mRNA實時熒光定量PCR檢測小鼠脂肪組織的巨噬細胞浸潤情況。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 軟件進行統計學分析。所有計量數據以均數±標準差(±s)表示，三組間計量數據比較采用單因素方差分析，若差異有統計學意義，再采用Tukey'spost hoc 分析進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠的血糖、胰島素水平比較 干預4 周后，三組小鼠的FPG 水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)；肥胖組和肥胖+PD-1 組小鼠的血漿Fins 和HOMA-IR 水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，而肥胖組小鼠的血漿胰島素和HOMA-IR水平分別與肥胖+PD-1 組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 三組小鼠的血糖及胰島素水平比較（±s）

表1 三組小鼠的血糖及胰島素水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.001。

組別對照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值HOMA-IR 14.34±2.25 80.25±12.60a 76.19±9.85a 4.443 0.001只數10 10 10 FPG(mmol/L)5.45±0.23 5.23±1.12 5.34±0.62 0.123 0.808 Fins(ng/mL)1.74±0.18 10.18±1.17a 9.71±1.01a 5.321 0.001

2.2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較 肥胖組小鼠的尿酸水平明顯高于對照組，肥胖+PD-1 組小鼠的尿酸水平明顯低于肥胖組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。肥胖組和肥胖+PD-1 組小鼠的甘油三酯、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但肥胖+PD-1 組與肥胖組小鼠的上述指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。三組小鼠的ALT、AST、肌酐、尿素氮水平比較差異也均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較（±s）

表2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.001；與對照組比較，bP＜0.01；與肥胖組比較，cP＜0.01。

組別HDL-C(mmol/L)59.54±3.32 74.34±5.12a 72.43±4.12a 4.321 0.001只數對照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值10 10 10 TC(mmol/L)70.45±3.43 202.45±12.22a 204.32±11.55a 7.212 0.001 TG(mmol/L)92.30±7.32 288.30±24.36a 274.59±25.38a 6.332 0.001 LDL-C(mmol/L)13.23±1.12 62.44±5.32a 62.39±4.24a 4.323 0.001 ALT(U/L)66.65±15.43 71.49±11.40 59.32±21.22 0.832 0.27 AST(U/L)110.51±17.46 114.87±17.39 108.13±10.27 0.435 0.617肌酐(μmol/L)16.25±1.31 16.42±2.25 15.44±1.25 0.082 0.93尿素氮(mmol/L)41.29±3.24 37.09±5.24 40.49±6.59 0.898 0.122尿酸(mmol/L)104.78±25.42 143.56±29.29b 111.01±28.26c 3.434 0.001

2.3 三組小鼠的肝臟重量及內臟脂肪含量比較 肥胖組小鼠肝臟重量及肝臟重量/體質量比值明顯高于對照組，肥胖+PD-1 組小鼠肝臟重量及肝臟重量/體質量比值明顯低于肥胖組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。同時，肥胖組小鼠的肝臟甘油三酯含量明顯高于對照組，肥胖+PD-1 組小鼠肝臟甘油三酯含量明顯低于肥胖組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。肥胖組小鼠附睪白色脂肪組織(eWAT)重量及eWAT 重量/體質量比值明顯高于對照組，肥胖+PD-1 組小鼠eWAT 重量及eWAT 重量/體質量比值明顯于肥胖組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組小鼠的肝臟重量及eWAT重量比較（±s）

表3 三組小鼠的肝臟重量及eWAT重量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與對照組比較，bP＜0.01；與對照組比較，cP＜0.05；與肥胖組比較，dP＜0.01；與肥胖組比較，eP＜0.05。

肝臟甘油三酯含量(mmol/gprot)3.21±0.56 6.23±1.23b 4.32±0.65d 3.127 0.003組別對照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值只數10 10 10肝臟重量(mg)911.23±79.43 1082.34±133.28a 904.34±60.23d 4.211 0.001肝臟重量/體質量(mg/g)38.33±2.23 43.45±5.56c 39.73±2.32e 2.287 0.027 eWAT重量(mg)196.20±15.10 744.20±113.61a 264.02±24.26cd 5.323 0.001 eWAT重量/體質量(mg/g)8.23±0.45 30.23±4.23a 11.21±1.21bd 4.665 0.001

2.4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細胞浸潤情況比較 肥胖組小鼠M1 巨噬細胞標記物(Itgax)和F4/80(Adgre1)mRNA 水平明顯高于對照組，肥胖+PD-1 組小鼠Itgax 和Adgre1 mRNA 水平明顯低于肥胖組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；肥胖+PD-1組小鼠的M2巨噬細胞標記物(Mrc1)mRNA水平明顯高于肥胖組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細胞標記物mRNA水平比較（±s）

表4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細胞標記物mRNA水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；對照組比較，bP＜0.05；與肥胖組比較，cP＜0.01；與肥胖組比較，dP＜0.01。

組別對照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值Mrc1 1.02±0.12 0.89±0.14 1.27±0.11d 5.563 0.001只數10 10 10 Itgax 1.07±0.13 1.57±0.23a 0.87±0.15c 5.231 0.001 Adgre1 1.03±0.11 1.37±0.13b 0.81±0.12c 2.317 0.027

3 討論

肥胖會導致糖耐量異常、血脂水平升高、內臟脂肪含量顯著增加以及胰島素抵抗，本研究結果提示三組空腹血糖差異無統計學意義，但肥胖小鼠的空腹胰島素水平明顯高于對照組，考慮與肥胖引起顯著胰島素抵抗有關，這與既往研究結果相似[6-7]。此外，本研究還發現，盡管肥胖對肝功能、肌酐水平無明顯影響，但能顯著增加尿酸水平。目前肥胖引起尿酸水平增加的機制不明，可能與糖皮質激素過量引起的高胰島素血癥有關，因為高胰島素血癥減少了尿酸在腎臟近端腎小管的排泄，導致血尿酸水平升高[8-9]。既往研究顯示糖皮質激素引起的肥胖與食欲增加有關，一項慢性應激的動物模型，發現糖皮質激素能夠通過一系列相互關聯的杏仁核-邊緣系統-下丘腦事件導致對脂肪和碳水化合物的渴望增加[10]。

在本研究中，PD-1 抗體能夠改善肥胖引起的內臟脂肪沉積。研究發現，PD-1 抗體可通過激活M2型巨噬細胞，增加白色脂肪組織中脂肪的利用和褐色變[11]。目前PD-1 抗體對脂代謝的作用觀點不統一，有些學者認為PD-1 抗體可減少血漿甘油三酯，增加HDL-C[12]，但有些研究顯示PD-1 抗體對甘油三酯和HDL-C沒有顯著影響[13]，這可能與上述研究所采用的不同動物模型有一定相關性。高脂小鼠模型的研究得到陽性結果的可能性要高于非高脂模型。此外，上述研究采用的PD-1 劑量及干預時間也有所差異，這可能也是結論不一的原因之一。本研究顯示PD-1抗體并不能改善肥胖引起的高脂血癥，與上述陰性結果研究存在一些相同點，如動物模型都不是直接的高脂模型，且干預時間較短。

據研究報道，脂肪組織浸潤的巨噬細胞可能是促炎性細胞因子的主要來源[14-15]。本研究發現肥胖小鼠脂肪組織也存在巨噬細胞浸潤，特別是M1 巨噬細胞，這可能是肥胖相關代謝紊亂的原因之一。本研究還發現PD-1抗體能改善肥胖小鼠脂肪組織中巨噬細胞浸潤，并促進M1 型巨噬細胞轉化為M2 型巨噬細胞，提示PD-1 抗體可以改善肥胖相關的脂肪組織慢性炎癥。

綜上所述，PD-1 抗體能夠改善肥胖小鼠的內臟脂肪沉積和尿酸水平升高，抑制巨噬細胞在脂肪組織的浸潤，有望成為預防和治療肥胖相關代謝紊亂的新方向。