在線前衍生化-高效液相色譜法檢測滄州金絲小棗中的氨基酸

劉憲軍 王曉明 來創(chuàng)業(yè) 王猛 劉本發(fā)

摘 要：本文建立了在線前衍生化-高效液相色譜法檢測滄州金絲小棗中的氨基酸。對氨基酸的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最終萃取條件：提取的溶劑為0.1 moL/L的HCl;提取的時間為50 min;提取的溫度為80 ℃;采用200 mm×2.1 mm的AA色譜柱和保護(hù)柱，以20 mmoL醋酸鈉溶液+0.018%TEA為流動相A，20%的20 mmoL醋酸鈉溶液（用1%～2%醋酸調(diào)pH值至7.2）+40%乙腈+40%甲醇為流動相B;柱流速定為0.45 mL/min。該方法的檢出限為1.0～2.0 mg/kg;平均加標(biāo)回收率為80.0%～103.0%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%～11.1%。該方法的重現(xiàn)性較好、靈敏度高，可用于滄州金絲小棗中氨基酸的檢測。

關(guān)鍵詞：在線前衍生化-高效液相色譜法;滄州金絲小棗;氨基酸

Abstract： In this paper， an online pre-derivatization-high performance liquid chromatography method was established for the determination of amino acids in Cangzhou jujube. The extraction conditions of amino acids were optimized， and the final extraction conditions were determined to be the extraction solvent of 0.1 moL/L HCl; the extraction time was 50 min; the extraction temperature was 80 ℃; a 200 mm×2.1 mm AA column and Guard column， use mobile phase A as 20 mmol sodium acetate solution + 0.018% TEA， adjust pH to 7.2 with 1%～2% acetic acid and 20 mmol sodium acetate solution of 20% mobile phase （adjust pH to 7.2 with 1%～2% acetic acid） +40 % acetonitrile +40% methanol was used as the mobile phase; the column flow rate was set at 0.45 mL/min. The detection limit of the method was 1.0～2.0 mg/kg; the average recovery was 80.0%～103.0%; the relative standard deviation was 6.2%～11.1%. The method has good reproducibility and high sensitivity， and can be used for the detection of amino acids in Cangzhou jujube.

Keywords： pre-online derivatization-high performance liquid chromatography; Cangzhou golden silk jujube; amino acid

滄州金絲小棗又名西河紅棗，因干棗剝開時有金黃絲相連，入口甜如蜜，外形如珠似璣，故稱金絲小棗。滄州金絲小棗被視為良好的滋補(bǔ)品，具有益心潤肺、合脾健胃、益氣生津、補(bǔ)血養(yǎng)顏之功效。目前用于氨基酸分析檢測的方法主要有茚三酮比色法、氨基酸自動分析儀法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法等[1-8]。本文建立了在線前衍生化 - 高效液相色譜法檢測滄州金絲小棗中的氨基酸，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與試劑

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)中使用的儀器與試劑見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：200 mm×2.1mm AA柱和保護(hù)柱;流動相：A=20 mmol 醋酸鈉+0.018% TEA，用1%～2%醋酸調(diào)pH值至7.2，B=20%的20 mmoL醋酸鈉（用1%～2%醋酸調(diào)pH值至7.2）+40%乙腈和40%甲醇。

流速：0.45 mL/min;A 壓縮性：5.0×10-3 kPa;B壓縮性：1.15×10-2 kPa;沖程：A和B自動洗脫程序：梯度洗脫（100% A，17 min到40%A∶60%B，18 min到100% B，18.1 min時流速0.45 mL/min，18.5 min時流速0.8 mL/min，23.9 min時流速0.8 mL/min，24 min時100% B，流速0.45 mL/min，25 min時0% B）。

1.2.2 檢測器（紫外檢測器）設(shè)置條件

0 min時：信號A=338/10 nm，參考=390/20 nm;信號B=261/16 nm，參考=324/8 nm。

15 min時：信號A=262/16 nm，參考=324/8 nm;柱溫：40 ℃;延遲時間：5 min。

1.2.3 進(jìn)樣器程序

10～14號瓶為1 mL進(jìn)樣瓶，分別裝有硼酸緩沖液、OPA試劑、水、樣品、FMOC。

進(jìn)樣器程序?yàn)椋孩購?0號瓶中吸取5.0 μL硼酸緩沖液;②從11號瓶中吸取1.0 μL OPA試劑;③從12號瓶中吸取0.0 μL水;④從13號瓶中吸取樣品;⑤從12號瓶中吸取0.0 μL水;⑥8 μL原位混合，最大速度，6次;⑦從14號瓶中吸取1.0 μL FMOC;⑧從12號瓶中吸取0.0 μL 水;⑨9 μL原位混合，最大速度，3次;⑩進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇及優(yōu)化

選擇了3種提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，其中包括純水、一定濃度HCl溶液和NaOH溶液。本試驗(yàn)采取了兩種提取方式：80 ℃水浴提取法、超聲波萃取儀提取法。對幾個處理的條件進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)和優(yōu)化，包括提取方式的選擇（80 ℃水浴提取法和超聲提取法）、提取試劑的選擇（純水、HCl溶液和NaOH溶液）和提取持續(xù)的時間等。本文在進(jìn)行上述的各種前處理?xiàng)l件的比較選擇時，是根據(jù)比較被測的滄州金絲小棗樣品中氨基酸的各組分在儀器中的響應(yīng)值的大小。

2.1.1 提取方式的選擇

水浴提取法的試驗(yàn)條件為稱取2 g棗粉，放入250 mL帶塞錐形瓶中，加入50 mL的純水，在80 ℃的水浴的條件下反復(fù)浸提30 min，提取完畢后，進(jìn)行冷凍離心，取上清部分，過0.45 μm的水相微孔濾膜;超聲提取法的試驗(yàn)條件為稱取2 g棗粉，放入250 mL有塞的錐形瓶中，加入50 mL的純水，超聲提取30 min，提取完畢后，進(jìn)行冷凍離心，取上清部分，過0.45 μm的水相微孔濾膜，每種提取方式做了6個平行樣品，進(jìn)行數(shù)值比較，發(fā)現(xiàn)水浴提取法效果好，因此選擇了水浴提取法的方式。

2.1.2 提取溶劑的選擇

選擇了3種提取溶劑進(jìn)行了試驗(yàn)，其中包括純水、0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH 3種溶劑。在試驗(yàn)結(jié)果中，使用0.1 mol/L濃度的HCl所提取出的氨基酸總量明顯高于純水和0.1 mol/L濃度的NaOH，通過比較發(fā)現(xiàn)，0.1 mol/L濃度的HCl作為提取溶劑所提取出的氨基酸種類是最多的，選擇0.1 mol/L濃度的HCl作為提取溶劑。

2.1.3 提取溫度的確定

選擇50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃ 5個溫度進(jìn)行比較試驗(yàn)。每一種水浴設(shè)置溫度平行處理6個樣品，檢測最后得出峰面積的平均值。通過計(jì)算檢測出的氨基酸的色譜峰平均面積，確定試驗(yàn)中水浴的設(shè)置溫度，選擇80 ℃作為試驗(yàn)水浴的提取設(shè)置溫度。

2.1.4 提取時間的確定

選擇5個提取時間進(jìn)行梯度比較，分別為：30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，通過比較分析色譜峰總面積，確定提取的時間。每個提取溫度做了6個平樣，取平均峰面積總和進(jìn)行比較。在提取時間為60 min時，氨基酸提取的總量達(dá)到最大值，選擇50 min為水浴的提取時間。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

配制系列標(biāo)準(zhǔn)液（1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/L及100.0 μg/mL），在1.2.1色譜的條件下對17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。色譜圖見圖1。根據(jù)各組分的濃度（X，μg/mL）與對應(yīng)的峰面積（Y）的關(guān)系，求得線性回歸方程，見表2。回歸分析表明，試驗(yàn)具有良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)r>0.999 4。

2.3 方法的回收率與精密度

添加濃度進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)7次（n=7），回收率的測算是在樣品中加入不同濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用外標(biāo)法定量，方法的精密度和回收率見表3。

3 結(jié)論

本文建立了在線衍生化-高效液相色譜法測定滄州金絲小棗中的氨基酸。對萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最終萃取條件為提取溶劑：0.1 moL/L的HCl;提取時間50 min;提取溫度80 ℃;采用200 mm×2.1mm AA柱和保護(hù)柱，以20 mmoL醋酸鈉+0.018%TEA溶液（用1%～2%醋酸調(diào)pH至7.2）為流動相A，以20%的20 mmoL醋酸鈉溶液（用1%～2%醋酸調(diào)pH值至7.2）+40%乙腈+40%甲醇為流動相B;流速為0.45 mL/min;方法檢出限為1.0～2.0 mg/kg，平均加標(biāo)回收率為80.0%～103.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%～11.1%。該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，可用于滄州金絲小棗中氨基酸的檢測。

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