酶聯免疫吸附測定法檢測淡水魚中孔雀石綠殘留

王洲 王君炎 閆達中 晁紅軍 吳菁

摘 要：目的：了解武漢市常青花園小區在售淡水魚產品的孔雀石綠污染情況。方法：利用酶聯免疫吸附測定法對常青花園周邊地區的3個菜市場和3個超市所售賣的常見淡水魚進行檢測。結果：共檢測組織樣本39份，其中檢測出孔雀石綠的樣本有21份，孔雀石綠檢出率為53.8%;超出國家標準的樣本有13份，不合格率為33.3%。結論：該區域在售淡水魚中孔雀石綠的殘留情況比較突出。由于試驗樣本的來源難以進一步追溯，確定孔雀石綠違規添加的環節難度較大，亟需市場監管部門對市售淡水魚產品從養殖、運輸到售賣全鏈條建立起清晰可查的溯源體系，以便更好地保障市民的食品安全。

關鍵詞：酶聯免疫吸附測定法;孔雀石綠;淡水魚

Abstract： Objective： To understand the malachite green pollution of freshwater fish products sold in Changqing Garden community， Wuhan. Methods： The enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect malachite green residues in common freshwater fish sold in three markets and three supermarkets in surrounding area. Results： Malachite green residues were detected from a total of 21 items in 39 commercially available freshwater fishes， with the detection rate was 53.8%， and 13 items exceeded the national standard， with a positive detection rate of 33.3%. Conclusions： It shows that the residue of malachite green in freshwater fish sold in this area is more prominent. As the source of the experimental samples is difficult to trace further， it is difficult to determine the illegal addition of malachite green. Therefore， it is necessary for the market supervision department to establish a clear and traceable traceability system for the whole chain of freshwater fish products sold on the market from breeding， transportation to sale， so as to better guarantee the food safety of citizens.

Keywords： enzyme-linked immunosorbent assay; malachite green; freshwater fish

孔雀石綠（Malachite Green，MG），外觀呈綠色，為有金屬光澤的結晶體。孔雀石綠主要是以苯甲醛和N，N-二甲基苯胺作為底物經過一系列化學反應而制得，易溶于水，對治療水產品疾病有較好的作用[1]。孔雀石綠用作漁藥可有效防治水產養殖中常見的病害，如水霉病、小瓜蟲病等[2]，對細菌、蟲等病害也能夠進行有效控制[3]。但是，大量研究顯示孔雀石綠在養殖動物體內代謝緩慢，殘留時間長，并且孔雀石綠及其代謝物會致畸、致癌、致突變[4-5]。

2002年，孔雀石綠被列入我國《食品動物禁用的獸藥以及其他化合物清單》，規定在食用動物飼養過程中不得添加孔雀石綠。同時，在《無公害食品 水產品中漁藥殘留限量》中明確規定水產品中不得檢出孔雀石綠，但因孔雀石綠價格低廉、使用簡單，抗菌效果好、對其毒副作用宣傳力度不夠，部分養殖戶仍然違規將其用于水產養殖[6]。

目前，檢測孔雀石綠殘留的方法主要有高效液相色譜法[7]、光譜法[8]、電化學法[9]、免疫學測定法[10]。其中，酶聯免疫法是一種抗原特異性檢測方法，樣本或標準品中的孔雀石綠和HRP標記的孔雀石綠競爭結合微孔板中抗孔雀石綠單克隆抗體，洗滌后顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠量成負相關。該方法不僅能快速、靈敏地檢測水產品中的孔雀石綠殘留，還具有低成本、檢測結果準確可靠等優點[11]。

本研究選擇武漢輕工大學附近的常青花園小區作為檢測點，檢測大型社區在售水產品的食品安全。常青花園地處武漢市北三環，臨地鐵2號線和6號線，交通便利，周圍無大型工廠，常住人口20萬左右，對水產品需求量大。對常青花園小區的水產品市場前期調查發現，該地區常青菜場、美聯菜場、石橋菜場和A超市、B超市、C超市的水產區多售賣鯽魚、草魚、鳊魚、鯉魚、財魚和鱸魚等淡水魚類。考慮到孔雀石綠在鯽魚體內代謝緩慢，無法完全代謝[12]，而鳊魚、鱸魚在養殖時易患水霉病[13-14]，且這3種魚也在各市場所有攤位均有售賣，因此本試驗中優先對鯽魚、鳊魚及鱸魚進行檢測，其他魚類結合實際情況進行抽樣調查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠酶聯免疫檢測試劑盒（上海臻科生物），檢測方法見說明書;氯化鈉（國藥集團）;正己烷（國藥集團）;乙腈（國藥集團）。

1.2 儀器與設備

多功能酶標儀（德國PerkinElmer，EnSpire 2300）;濃縮儀（常州阿米勒，YPNSY-12）、離心機（長沙湘儀，H1850R）;勻漿機（新寶儀器廠，FSH-2A）;電子天平（上海天美YP1002N，感量0.01 g）。

1.3 購買魚類的主要場所及種類

本試驗主要檢測了常青花園地區3個菜市場和3個大型超市。3個菜市場里主營淡水養殖魚類的共有7家（同一個菜場不同的攤位用A、B、C來表示），從其中購買的魚類品種如表1所示。

1.4 試驗方法

1.4.1 試劑準備

25%氯化鈉溶液、將試劑盒中提供的2×濃縮復溶液、20×濃縮洗滌液稀釋至1×，所有試劑在使用前平衡至室溫。

1.4.2 樣品的制備與提取

（1）組織樣品的處理。除去非食用部分，剪碎魚肉后，用勻漿機充分磨碎樣品;取4 g樣品于50 mL離心管中，加入2 mL的25%氯化鈉溶液，振蕩2 min;依次加入100 μL提取劑1，4 mL乙腈，2 mL正己烷，充分振蕩;4 000 r/min離心5 min，取中層清澈液體2～5 mL，加入50 μL氧化劑，輕輕振蕩混合30 s;在65 ℃下空氣流吹干，加入1 mL復溶液溶解干燥殘留物，振蕩1 min，取50 μL檢測。按說明書要求每組做2個平行。

（2）水樣品處理。取50 μL市場收集的水樣與450 μL已稀釋好的復溶液充分混合30 s，取50 μL進行分析檢測。每組2個平行。

1.4.3 酶聯吸附和顯色

在試驗開始前，將微量測試孔提前從4 ℃冰箱中取出，室溫平衡30 min。在微孔中加50 μL待測樣品，然后加入50 μL抗體工作液，充分混勻后用蓋板膜將微孔板封閉，輕敲微孔板邊緣振蕩混勻。在室溫環境下，反應30 min。

反應結束后，將抗體和樣品的混合液倒出并甩干孔板，取250 μL洗滌液加在待測微孔中，洗板4～5次，洗板間隔15～30 s。洗板結束后，取100 μL酶標記物加入待測微孔中，輕敲微孔板，混合均勻，用蓋板膜蓋板后將酶標板室溫孵育30 min，重復洗板步驟。待微孔板干燥后，取50 μL底物A溶液、50 μL底物B溶液加在待測微孔中，輕輕搖勻，將微孔板置于暗處充分顯色15 min，最后取50 μL終止液迅速加到微孔中終止反應。

1.4.4 計算公式

式中：B為各標準品或樣本溶液吸光度均值;B0為標準液吸光度均值。

1.4.5 分析檢測

使用酶標儀在450 nm處進行檢測，數據采集在5 min內完成。

1.4.6 數據處理

在450 nm波長下，測定標準品3次。以按式（1）計算出各濃度標準品的百分吸光率作為縱坐標，以各標準品濃度的對數形式作為橫坐標，用CurveExpert（1.4）繪制出標準曲線圖。酶標儀讀取樣品2次，取平均值，以標準曲線求得孔雀石綠殘留量。

2 結果與分析

2.1 各市場魚類來源

通過市場調查發現大型超市均有自己的供應商，而菜場零售攤販基本是從四季美農貿城采購再行售賣，不同市場的進貨來源如表2所示。受客觀因素影響，2020年后距離常青花園最近的華南海鮮批發市場停業，四季美農貿城成為距離常青花園地區最近的農產品批發市場（約15 km），因此幾乎所有的零售攤販都選擇去四季美農貿城進貨，僅有極少數攤販選擇去距離常青花園地區約27 km的白沙洲農副產品批發市場進行采購。

2.2 標準曲線

孔雀石綠的標準曲線以各濃度標準品的百分吸光度值為縱坐標，各標準品濃度轉換成對數為橫坐標，得到標準曲線，如圖1所示，相關系數為0.986。

2.3 孔雀石綠殘留含量測定

本次試驗采用上海臻科生物技術有限公司的試劑盒，針對常青花園市場水產品進行集中收集分析，根據試劑廠家給出的樣品分析程序，對得到的吸光度值進行分析，得到孔雀石綠的殘留量，如表3所示。結合《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》，孔雀石綠在水產品中的檢出限為0.5 μg/kg，即國家規定每克水產品中孔雀石綠的檢出量不得超過0.5 ng/g。

由表3可知，在檢測的39份組織樣本中，檢出（試劑盒檢出限為0.1 ng/g）孔雀石綠的樣品為21個，占全部樣本的53.8%，其中超出國家規定檢出量的不合格樣本有13個，占全部樣本的33.3%。不合格樣本分別是常青花園菜場A家鯽魚、鱸魚、財魚，常青花園菜場B家鱸魚、鯽魚;石橋菜場A家草魚、鳊魚，石橋菜場C家鱸魚;美聯菜場A家鱸魚、鳊魚;C超市鳊魚;B超市鳊魚;A鰱魚。在優先檢測的鯽魚、鳊魚和鱸魚中，鯽魚的不合格率相對較低，為20%，鳊魚和鱸魚的不合格率是40%，說明在易患水霉病等疾病的魚類中違規添加孔雀石綠的情況更加嚴重;結合抽查的草魚（16.7%）和財魚（50%）的不合格率檢出結果，基本符合單價越高的淡水魚中孔雀石綠殘留幾率越高的規律，在2011—2013年對武漢市市售水產品污染檢測的結果也基本符合這個規律[15]。可能是因為售價高的魚類染病或死亡，會帶來更大的損失，因此養殖戶、中間商或商家為了延長魚的存活時間，在養殖、運輸或存放期間，可能違規添加孔雀石綠。

盡管3個菜場進貨的批發市場相同，但批發市場是不同貨源集散地，同種魚類的養殖、運輸情況都可能不一樣，檢出的孔雀石綠情況沒有很強的規律性也證明了這一點。3個超市都有自己的供貨商，可以看出來源于不同供貨商的魚檢出情況也不相同。為了確認是哪個環節存在違規添加孔雀石綠的情況，筆者還抽查了購買樣品時帶回的水樣，發現在常青花園A家攤位取回的水樣中，孔雀石綠的濃度高達49.6 ng/g，該家售賣的5種魚中，有3種魚孔雀石綠殘留超標，說明該店很有可能在銷售過程中違規添加了孔雀石綠。其他檢測水樣中未檢出孔雀石綠，但仍然有部分魚類組織中有檢出或超標檢出孔雀石綠的情況，這可能是魚類在養殖或運輸中暴露在有孔雀石綠的環境中。

整體說來，此次檢測的結果并不樂觀，來自農貿批發市場的菜場樣本中檢出率為53.57%，不合格率為35.71%，擁有自有供應商的超市檢出率為54.55%，不合格率為27.27%。對菜場和超市的檢出率和不合格率進行卡方檢驗分析，結果表明菜場和超市的檢出率（χ2=0.049）和不合格率（χ2=0.121）無顯著差異（置信度95%）。在本次檢測中，孔雀石綠的檢出率都超過了50%，但菜場樣本中不合格率高于超市樣本，基本與2011—2013年武漢市大范圍集貿市場和超市中水產品的檢測過程中發現的集貿市場污染物檢出率大于超市[15]的結果吻合，這可能是因為菜場的水產品樣品來源和銷售途徑更復雜，很難追蹤商品源頭及運輸情況。各大型超市的水產品來自特定供應商，有比較清晰的來源，更容易進行來源追溯的。孔雀石綠檢出但并不超標的現象則可能是因為養殖環境中殘留孔雀石綠的影響[12-14]。

3 結論與討論

我國水產品中各類藥物殘留是制約其出口的主要問題，其中孔雀石綠潛在的毒副作用對人體有很大的危害，一直是食品安全關注的重點。在2011—2013年武漢市市售水產品氯霉素、孔雀石綠、結晶紫污染檢測中，孔雀石綠檢出率最高[15-16]。時隔8年，為了解該情況是否有改善，選擇周邊地區水產品檢測孔雀石綠的殘留。在武漢市常青花園地區售賣的39份常見淡水魚檢測樣本中，有孔雀石綠殘留但未超過國家規定標準的有8份，孔雀石綠殘留超過國家規定標準的樣本為13份，不合格概率達33.3%。為了測試酶聯免疫吸附檢測法的可靠性，不少研究者曾對他們當地水產品的孔雀石綠殘留進行了檢測。相比王耀偉[11]107份樣品中的2份陽性、曾蓉等[17]43份樣品中的3份陽性、王敏娟等[18]328份樣品中的24份陽性結果，本次檢測的陽性檢出率要高得多，與深圳2016年的檢出率相當[19]。與高效液相色譜法相比，酶聯免疫吸附測定法在檢測精度上還有待進一步提高，但該檢測法對高端儀器的依賴度較低，且在眾多應用領域都經過了長期的實踐檢驗，有較好的參考價值，適合進行快速、大批量的檢測。

針對本次檢測結果的分析可以發現，少部分商家會在零售終端違規添加孔雀石綠，但更多的可能還是在魚類飼養或運輸環節存在違規使用了孔雀石綠，且價值越高的魚類，其孔雀石綠添加概率可能越高。需要說明的是，本次試驗的檢測范圍較為有限，且沒有進行長期的市場跟蹤，因此不同批次的結果可能會有一定的波動。但整體而言，本次抽樣檢測的結果表明，武漢市乃至更大范圍的水產品市場需要更有力、更有效的市場監管和規范。

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