微波協同L-苯丙氨酸處理對苦蕎萌發中黃酮的影響

許先猛，卞紫秀，王順民, ，陸 寧，張慧敏，王俊珍

（1.亳州學院生物與食品工程系，安徽亳州 236800；2.藥食同源功能食品亳州市重點實驗室，安徽亳州 236800；3.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽蕪湖 241000；4.四川省涼山州西昌農業科學研究所，四川西昌 615000）

苦蕎（Tartary buckwheat）是一種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，富含黃酮、多肽、植物甾醇等生物活性成分[1?2]?？嗍w中黃酮類化合物含量豐富[3?5]，這是苦蕎區別于其它禾谷類作物的顯著特征?？嗍w萌發后黃酮類化合物含量顯著增加，提高了其芽苗的營養價值和保健作用[6]。黃酮類化合物是苦蕎在萌發過程中產生的一類次生代謝產物，其合成途徑受光[7]、磁場[8]、激素、鹽脅迫等逆境因子調控。

微波屬于一種電磁波，能夠引發生物體內的生理生化反應[9]，微波非熱效應還能夠改變細胞膜表面的電荷密度和膜內外電壓變化。近年來，國內學者[10?14]開展了大量關于微波處理提高種子活力和生物量積累的研究工作，包括冰草、苜蓿、大豆、黃豌豆和蔬菜等。研究表明，微波處理苦蕎能夠對其萌發產生一定生物效應，從而促進種子的萌發和萌發過程中黃酮類物質的合成[15]。植物代謝過程中的黃酮類物質是以苯丙烷類物質作為底物，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構酶（CHI）和黃酮醇合酶（FLS）等多種酶的作用下合成[16]。苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）屬于芳香族氨基酸，是苯丙烷代謝的前體物質，對植物的苯丙烷代謝起著重要作用[15]。Seo等[17]研究指出，添加外源5 mmol/L的L-苯丙氨酸（Lphenylalanine，L-Phe）能夠顯著促進苦蕎麥芽中酚類單體及總酚類化合物的合成。目前，采用單一微波處理或者L-Phe處理促進種子萌發和富集黃酮研究較多，但微波協同L-Phe處理苦蕎種子促進發芽苦蕎富集黃酮類化合物等研究鮮見報道。

本課題組前期研究表明[15]，在微波功率400 W條件下處理10 s協同5 mmol/L L-Phe處理下，萌發第7 d苦蕎芽中黃酮含量為5.1 g/100 g。為確定微波協同L-Phe處理下苦蕎萌發富集黃酮的最佳工藝，本研究進一步考察了微波時間、微波功率、不同濃度L-Phe營養液處理對萌發苦蕎芽中黃酮類物質富集的影響，并通過響應面設計法優化微波協同LPhe處理對苦蕎萌發富集黃酮的工藝條件。采用高效液相色譜法對萌發苦蕎芽中黃酮成分進行分析，初步明確苦蕎芽中部分黃酮成分和含量，以期為微波協同L-Phe促進苦蕎萌發富集黃酮的機理研究提供參考，為苦蕎芽產品和富含苦蕎芽黃酮類化合物功能食品的開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川蕎1號苦蕎種子 產自四川涼山，購買當年產、自然陰干的苦蕎種子，置于4 ℃冰箱貯存備用；L-Phe 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；綠原酸、牡荊素 色譜純，中國藥品生物藥品檢定所；蘆丁標準品 色譜純，北京普天同創生物科技有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水楊酸、蔗糖、葡萄糖、苯酚和濃硫酸

分析純，國藥集團化學試劑有限公司；高錳酸鉀分析純，宿州化學試劑廠。

P4543-1風力懸浮控溫微波裝置 安徽工程大學與蕪湖眾維教研儀器研發公司共同研發；YRG-300光照種子發芽箱 上海臺恒儀器設備有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司；Waters2487高效液相色譜儀 美國Waters公司；L3S可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；JY1002電子天平 上海精密科學儀器有限公司；KS-100DE液晶超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；TGL-16A醫用離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎種子預處理 苦蕎種子預處理參照趙強等[18]方法，并略做調整：選取顆粒飽滿、均勻、無霉變的苦蕎種子適量，1.0 g/L高錳酸鉀溶液消毒，消毒時間5 min，蒸餾水沖洗，然后在室溫條件下用蒸餾水浸泡催芽4 h，中間換一次水。催芽后過濾，濾紙吸除苦蕎種子表面水分，備用。

1.2.2 苦蕎萌發富集黃酮 定量稱取催芽后苦蕎種子，采用一定微波功率，分別微波處理一定時間，微波溫度為（40±2）℃。然后，將種子均勻平鋪于發芽盤上，發芽盤底盤裝入營養液，營養液為一定濃度的L-Phe溶液，營養液液面剛剛接觸發芽盤鋪種盤，每24 h更換一次營養液，發芽盤置于種子發芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培養7 d，以未經微波處理的苦蕎種子組為對照，分別取培養1、3、5、7 d的苦蕎芽進行指標測定。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 微波時間對萌發苦蕎芽中黃酮含量影響定量稱取催芽后苦蕎種子，采用微波功率300 W，分別處理25、50、75和100 s，微波溫度為（40±2）℃。然后，將種子均勻平鋪于發芽盤上，發芽盤底盤裝入營養液，營養液為0 mmol/L的L-Phe溶液（蒸餾水），營養液液面剛剛接觸發芽盤鋪種盤，每24 h更換一次營養液，發芽盤置于種子發芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培養7 d，以未經微波處理的苦蕎種子組為對照，分別取培養1、3、5、7 d的苦蕎芽進行指標測定。

1.2.3.2 微波功率對萌發苦蕎芽中黃酮含量影響定量稱取催芽后苦蕎種子，分別采用微波功率200、300、400和500 W處理50 s，微波溫度為（40±2）℃。然后，將種子均勻平鋪于發芽盤上，發芽盤底盤裝入營養液，營養液為0 mmol/L的L-Phe溶液（蒸餾水），營養液液面剛剛接觸發芽盤鋪種盤，每24 h更換一次營養液，發芽盤置于種子發芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培養7 d，以未經微波處理的苦蕎種子組為對照，分別取培養1、3、5、7 d的苦蕎芽進行指標測定。

1.2.3.3 L-Phe濃度對萌發苦蕎芽中黃酮含量影響定量稱取催芽后苦蕎種子，將種子均勻平鋪于發芽盤上（不進行微波處理），發芽盤底盤裝入營養液，營養液為0、1、2、3、4、5 mmol/L的L-Phe溶液，營養液液面剛剛接觸發芽盤鋪種盤，每24 h更換一次營養液，發芽盤置于種子發芽箱（25 ℃，75%±5% RH）中避光培養7 d，分別取培養1、3、5、7 d的苦蕎芽進行指標測定。

1.2.4 苦蕎萌發富集黃酮響應面試驗設計 以苦蕎芽中黃酮含量為指標，采用Design expert軟件CCD響應面分析法，對微波功率、微波時間、營養液LPhe濃度3個因素進行響應面設計，研究各因素及各因素交互所用對苦蕎芽中黃酮含量的影響，并采用二次多項式回歸方程進行模型預測，以優化微波協同L-Phe處理苦蕎萌發富集黃酮的最佳工藝條件。試驗因素水平表見表1。

1.2.5 苦蕎芽中黃酮含量的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[19?20]測定苦蕎芽中黃酮含量?？嗍w芽于?40 ℃溫度下真空冷凍干燥48 h，準確稱取0.5 g苦蕎芽凍干干樣，置于研缽中充分粉碎，加入5 mL 60%乙醇溶液，置于350 W超聲功率下恒溫（50 ℃）提取0.5 h，然后在8000 r/min離心10 min，取上清液；沉淀物加入5 mL 60%乙醇溶液再次提取，連續提取三次，合并提取液，并定容至25 mL，備用。以不加樣液為對照，在波長為502 nm處測定吸光度值。以蘆丁標準品繪制標準曲線，結果以每克苦蕎芽中所含蘆丁當量表示（g/100 g）測定樣品（干基）中黃酮的含量。

1.2.6 苦蕎芽黃酮成分高效液相色譜（HPLC）分析

1.2.6.1 測定波長選擇 研究表明，苦蕎萌發后黃酮中含量較高的成分有蘆丁、綠原酸、牡荊素等[21]，因此本研究用紫外分光光度計對標準品蘆丁、綠原酸、牡荊素溶液分別進行全波長紫外掃描。得到各單酚在紫外區的最大吸收波長，進一步確定最佳測定波長。

1.2.6.2 混合標準品溶液配制 分別精確稱取標準品10.0 mg綠原酸、3.0 mg牡荊素、5.0 mg蘆丁于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得到1.0 mg/mL綠原酸、0.3 mg/mL牡荊素、0.5 mg/mL蘆丁的混合標準品溶液，避光冷藏，備用。

1.2.6.3 樣品溶液制備 苦蕎種子經消毒、催芽，采用微波功率250 W處理90 s，微波溫度為（40±2）℃，在溫度25 ℃，濕度75%±5% RH條件下避光培養7 d，發芽盤底盤中裝入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作為營養液。取培養萌發7 d苦蕎芽，在?40 ℃溫度下真空冷凍干燥48 h，將苦蕎芽干樣置于研缽中充分粉碎。精確稱取2.5 g（精確到0.0001 g）苦蕎芽干粉，加入75%乙醇溶液30 mL，80 ℃下回流提取1 h（重復2次），過濾后合并濾液。待旋蒸至干后，殘渣加丙酮溶解并定容至5 mL，過0.45 μm微孔濾膜后，待測?？瞻自囼灒涸囼炛兴褂玫脑噭┌瓷鲜龇椒ㄌ幚砗?，進行HPLC分析。

1.2.6.4 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（4.6 m×250 mm×5 μm）；檢測器：DAD檢測器；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；波長：330 nm；流動相A（乙腈溶液）和流動相B（0.4%磷酸溶液）梯度洗脫35 min，梯度程序為：0 min，6%A，94%B；0~30 min，18%A，82%B；30~35 min，6%A，94%B。

1.3 數據統計與分析

實驗為3次重復，結果以平均值±標準差的形式表示。用SPSS 22.0軟件中的Duncan’s多重比較法進行方差分析，顯著水平為P<0.05。采用Sigmaplot 10.0和Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 苦蕎萌發富集黃酮單因素實驗結果

2.1.1 微波時間對萌發苦蕎芽中黃酮含量的影響微波時間對萌發苦蕎芽中黃酮含量的影響結果如圖1。由圖1可知，苦蕎芽中的黃酮含量隨著苦蕎培養時間的延長逐漸增加，隨著微波時間的延長呈現先增加后減少的趨勢。在微波時間50、75 s時，苦蕎芽中黃酮含量與對照組比較顯著增加（P<0.05），在微波功率300 W下處理75 s，微波溫度為（40±2）℃，苦蕎萌發第7 d苦蕎芽中的黃酮含量最高，與對照組比較提高了3.25%。這是由于微波預處理可以促進谷物的次生代謝過程，從而增加發芽谷物中黃酮等次生代謝產物的含量，Randhir等[22]研究結果顯示，蠶豆經微波處理后萌發的蠶豆芽苗中酚類物質的含量增加700%。王順民等[23]研究表明，微波處理豌豆后豌豆芽黃酮含量較對照組增加了23.3%，達1.48 mg/100 mg。大米[24]和黍米[25]經微波處理后萌發，胚芽米的胚芽油中α-生育酚和植物甾醇含量分別增加約1.5倍和15%，黍米中的可接受性多酚的含量增加顯著，與本文結果類似。

圖1 微波時間對苦蕎芽中黃酮含量的影響Fig.1 Effect of microwave time on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts

2.1.2 微波功率對萌發苦蕎芽中黃酮含量的影響微波功率對萌發苦蕎芽中黃酮含量影響結果如圖2。由圖2可知，苦蕎芽中的黃酮含量隨著苦蕎培養時間的延長逐漸增加，隨著微波功率的增加呈現先增加后減少的趨勢。在微波功率200、300 W時，苦蕎芽中黃酮含量與對照組比較顯著增加（P<0.05），在微波功率400 W下處理50 s，微波溫度為（40±2）℃，苦蕎萌發第7 d苦蕎芽中的黃酮含量最高，與對照組比較提高了1.66%。這是由于微波輻射時間過長，微波功率過大都會對種子萌發產生負面影響[26?29]。微波輻射對種子萌發、萌發種芽中次生代謝產物和促進生物量積累的影響取決于種子類型，同時微波頻率、微波功率和微波時間等因素也有較大影響，這與張蕊思等[30]微波輻射對冰草種子生理特性影響的研究結果一致。

圖2 微波功率對苦蕎芽中黃酮含量的影響Fig.2 Effect of microwave power on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts

2.1.3 營養液L-Phe濃度對萌發苦蕎芽中黃酮含量的影響 營養液L-Phe濃度對萌發苦蕎芽中黃酮含量影響結果如圖3。由圖3可以看出，苦蕎芽中的黃酮含量隨著苦蕎培養時間的延長逐漸增加，而隨著營養液L-Phe濃度的增加呈現先增加后減少的趨勢。其中，在營養液L-Phe濃度為3.0 mmol/L條件下，苦蕎芽中的黃酮含量最高，苦蕎萌發第7 d時，苦蕎芽中黃酮含量與對照組比較提高了5.5%。同時，在營養液L-Phe濃度為3.0 mmol/L條件下，苦蕎萌發第7 d苦蕎芽中黃酮含量與苦蕎萌發第1 d比較提高了2.19倍。L-Phe是苦蕎萌發和生長過程中黃酮類物質合成的前體物質，因此苦蕎萌發和L-Phe營養液處理都能促進苦蕎黃芽中酮類化合物的合成，這與Seo等[17]研究結果一致。

圖3 L-Phe濃度對苦蕎芽中總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of L-Phe concentration on total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts

2.2 苦蕎萌發富集黃酮的響應面優化

2.2.1 響應面試驗結果 以苦蕎芽中黃酮含量（g/100 g）為指標進行響應面試驗設計，選取微波時間（A）、微波功率（B）和營養液L-Phe濃度（C）為影響因素，進行3因素3水平的響應面分析。試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 響應面試驗回歸模型及方差分析 應用Design-Expert V8.0.6軟件，對表2的數據進行處理、分析，預測模型為：R1=6.35?0.091A?0.19B?0.053 C?0.050AB+0.058AC+0.093BC?0.22A2?0.22B2?0.35C2。

對試驗結果進行擬合的二次模型方差分析，結果見表3。F值為96.38，回歸方程模型達到極顯著水平（P<0.0001），說明響應面模型極度顯著。根據各因素的F值可知，影響苦蕎萌發后黃酮含量的因素依次為B>A>C，交互項依次為BC>AC>AB。除AC、AB影響顯著（P<0.05）外，其他各項影響均極顯著（P<0.01）。多元決定系數為R2=0.9076，失擬P為0.1595（P>0.05），該模型預測值與實際試驗值擬合較好。可以利用該回歸方程對微波協同L-Phe處理對苦蕎萌發富集黃酮結果進行分析，對響應值進行預測。

2.2.3 響應面分析交互作用 由表3和圖4可知，微波功率B與微波時間A對苦蕎芽中黃酮含量的交互作用顯著（P<0.05）。當微波功率B一定時，苦蕎芽中黃酮含量隨著微波時間A的增加先增加后降低。在微波時間A為88.19 s，微波功率B為248.07 W時苦蕎芽中黃酮含量最高。L-Phe濃度C和微波時間A對苦蕎芽中黃酮含量的交互作用顯著（P<0.05）。當微波時間A一定時，苦蕎芽中黃酮含量隨著LPhe濃度C的增加先增加后降低，在L-Phe濃度為2.90 mmol/L時苦蕎芽中黃酮含量最高。L-Phe濃度C和微波功率B對苦蕎芽中黃酮含量的的交互作用極顯著（P<0.01）。當微波功率B一定時，苦蕎芽中黃酮含量隨著L-Phe濃度C的升高呈現先增加后降低的趨勢。以上分析與方差分析結果一致。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments

圖4 因子交互作用對苦蕎芽中總黃酮含量的曲面圖與等高線圖Fig.4 Surface plot and contour plot of total flavonoid content in tartary buckwheat sprouts of the interaction between factors

2.3 驗證實驗

利用Design-expert 8.0軟件在設定的因素水平內對回歸方程進行數學規劃，得到微波協同LPhe處理對苦蕎萌發富集黃酮各因素最優值為：苦蕎種子經消毒、催芽，采用微波功率248.07 W處理88.19 s，微波溫度為（40±2）℃，在溫度25 ℃，濕度75%±5%RH條件下避光培養7 d，發芽盤底盤中裝入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作為營養液，培養第7 d萌發的苦蕎芽中黃酮含量預測值為6.30 g/100 g。經校正，微波協同L-Phe處理對苦蕎萌發富集黃酮條件為：苦蕎種子經消毒、催芽，采用微波功率250 W處理90 s，微波溫度為（40±2）℃，在溫度25 ℃，濕度75%±5% RH條件下避光培養7 d，發芽盤底盤中裝入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作為營養液，培養第7 d萌發的苦蕎芽中測定黃酮含量為6.26 g/100 g。驗證實驗表明，微波協同L-Phe處理促進苦蕎萌發富集黃酮，苦蕎芽中黃酮含量預測值與實際測定值接近，經響應面優化所得的微波協同L-Phe處理對苦蕎萌發富集黃酮工藝科學可信，具有指導實際生產的應用價值。

2.4 方法學考察結果

2.4.1 線性關系 分別精確吸取混合標準品溶液適量，配制系列質量濃度標準品溶液，注入液相色譜儀并測定。以各成分峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X, μg·mL?1）為橫坐標，進行線性回歸，其回歸方程見表4。

表4 各種成分的線性關系Table 4 Linerity of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精確吸取混合標準品溶液適量，注入液相色譜儀并測定，重復進樣6次，記錄色譜圖并計算峰面積的RSD。綠原酸、牡荊素、蘆丁峰面積RSD分別為0.32%、0.43%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批樣品（微波功率300 W，處理25 s樣品組）溶液，室溫下放置，分別于0、4、8、12、24 h時進樣測定，測得綠原酸、牡荊素、蘆丁峰面積RSD分別為0.63%、0.52%、0.57%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批樣品（微波功率400 W，處理50 s樣品組），制備樣品溶液6份，進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算各成分含量及其RSD。結果綠原酸、牡荊素、蘆丁平均含量分別為2.8815、0.5146、30.1142 mg·g?1，RSD分別為0.76%、0.63%、0.85%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 稱取已知含量樣品（微波功率400 W，處理50 s樣品組）9份，分成3組，精密稱定，分別加入混合標準溶液1.0、2.0、3.0 mL，進樣測定，記錄色譜圖，計算綠原酸、牡荊素、蘆丁加樣回收率在98.87%~102.31%范圍內，RSD在0.38%~0.81%范圍內。

2.5 苦蕎芽樣品黃酮含量測定結果

紫外掃描結果顯示，綠原酸、牡荊素、蘆丁標準品的最大吸收波長在330 nm左右，故將330 nm作為樣品紫外檢測波長?；旌蠘藴势啡芤汉蜆悠啡芤合♂尯筮M行HPLC分析，結果如圖5，同時記錄色譜圖，按外標法計算綠原酸、牡荊素、蘆丁含量，結果如表5。

圖5 混合標準品和樣品HPLC色譜圖Fig.5 The HPLC chromatogram of standards and samples

表5 樣品含量測定結果Table 5 Content determination results of samples

由圖5a可知，混合標準品中綠原酸保留時間是12.765 min；牡荊素保留時間是28.157 min；蘆丁保留時間是28.898 min。比較圖5a混合標準品色譜圖和圖5b樣品色譜圖的相對保留值，樣品中對應的綠原酸、牡荊素和蘆丁保留時間分別為：12.823、28.188、28.875 min。樣品中蘆丁含量最高，其次為綠原酸、牡荊素，由表5可知，其含量分別為31.8962、3.2764和0.5644 mg/g。此外，樣品中還含有多種其它成分，保留時間分別為：1.481、1.905、8.889、15.238、18.307、23.915、27.513、33.709 min，需要進一步的研究。

3 結論

微波處理和營養液L-Phe溶液處理都具有提高苦蕎芽中黃酮含量的作用，微波處理及營養液LPhe溶液處理在一定范圍內對苦蕎萌發富集黃酮類物質有協同促進作用。采用CCD響應面優化的方法，以苦蕎芽中黃酮含量為指標，優化得到微波協同L-Phe處理對苦蕎萌發富集黃酮的最佳工藝為：苦蕎種子經消毒、催芽，采用微波功率250 W處理90 s，微波溫度為（40±2）℃，在溫度25 ℃，濕度75%±5% RH條件下避光培養7 d，發芽盤底盤中裝入2.90 mmol/L的L-Phe溶液作為營養液，培養第7 d萌發的苦蕎芽中測定黃酮含量達到了6.26 g/100 g。

采用高效液相色譜法（HPLC）對苦蕎芽中黃酮成分進行分析，分離和確定出綠原酸、牡荊素、蘆丁三種黃酮類物質和含量，另外有8種成分需要進一步分析和確定。本研究為微波協同L-Phe促進苦蕎萌發富集黃酮的機理研究提供了參考，為苦蕎芽產品和富含苦蕎芽黃酮類化合物功能食品的開發提供了技術支持。