益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠慢性酒精性肝損傷的改善作用及機制研究

王 引，張蘭威

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000）

機體攝入的酒精超過90%在肝臟代謝，若長期酒精攝入產生的有害代謝產物超過肝臟的解毒能力，勢必對肝臟造成嚴重損傷[1]。研究表明，酒精及其代謝物乙醛被認為是酒精性肝損傷的病因[2]，氧化應激在急性或慢性酒精性肝損傷的發病機制中也起著重要作用[3?4]。因此，加速肝臟酒精代謝排出和預防氧化應激是延緩酒精性肝損傷發病的有效途徑。

目前，藥物干預仍是預防和治療酒精性肝損傷的主要方法，然而，藥物具有的嚴重副作用及不能為所有人所耐受的缺點使得探索天然成分的安全有效干預手段迫在眉睫[5]。益生菌對人體具有良好的生理生化功能，研究表明鼠李糖乳桿菌CCFM1107（Lactobacillus rhamnosusCCFM1107）能通過提高肝臟抗氧化酶活性、抑制脂質過氧化發揮對慢性酒精性肝損傷小鼠的保護作用[6]。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）作為存在于紅酒、葡萄、花生和其他各種植物中的一種多酚類物質，可抑制大鼠肝臟脂質過氧化，提高肝臟抗氧化酶活性，通過增強抗氧化防御體系預防慢性酒精干預造成的肝損傷[7]。然而，益生菌與白藜蘆醇通過降低機體氧化應激途徑預防酒精性肝損傷的研究均已有報道[8?9]，但兩者聯合作用是否具有更好的預防效果及可能機制還需進一步探明。

因此，本研究基于具有抗氧化及降脂活性的益生菌副干酪乳桿菌J5（Lactobacillus paracaseiJ5、L.paracaseiJ5）、干酪乳桿菌YRL577（Lactobacillus caseiYRL577、L. caseiYRL577）、動物雙歧桿菌F1-7（Bifidobacterium animalisF1-7，Bif.animalsF1-7）[10?12]，探討其分別聯合白藜蘆醇對慢性酒精性肝損傷的可能保護作用及潛在機制，以期為后續解酒護肝功能性產品的開發利用提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6J雄性小鼠（17~19 g） 濟南朋悅生物技術有限公司（許可證號SCXK（魯）20190003）；L.paracaseiJ5、L. caseiYRL577、Bif. animalsF1-7中國海洋大學功能乳品與益生菌工程實驗室保藏菌株；白藜蘆醇 純度98%，阿拉丁試劑；95%食品級酒精 河南鑫河陽酒精有限公司；MRS液體培養基

青島海博生物技術有限公司；無菌磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS） 北京Solarbio科技有限公司；甘油三脂（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；細胞色素酶CYP2E1（CYP2E1）ELISA試劑盒 艾萊薩生物科技（上海）有限公司；Trizol裂解液 美國Invertrogen；異丙醇、氯仿 國藥集團化學試劑有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、逆轉錄試劑盒 東洋紡生物科技有限公司；DEPC去離子水、BCA蛋白濃度試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

NanoDrop2000超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀 美國BIO-RAD公司；TP600PCR 擴增儀

寶日醫生物技術有限公司；Olympus CKX51倒置顯微鏡 奧林巴斯公司；UV-2550紫外分光光度計

蘇州島津儀器公司；NIKON/Ni-E電動熒光顯微鏡

日本尼康公司；TG20KR-D高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司；Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Scientific公司；AB135-S分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 菌株以2%（v/v）接種量分別接種于MRS液體培養基，37 ℃恒溫培養24 h。將培養后的菌株發酵液在4 ℃條件下以8000 r/min離心5 min，棄去上清，菌體重懸于無菌PBS洗滌兩次，通過平板計數法獲得菌體濃度為109CFU/mL的PBS菌懸液，使用前臨時置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 動物模型與分組 42只雄性C57BL/6J小鼠在清潔級、12 h光照/黑暗交替、（23±2）℃溫度、（50%±10%）相對濕度的動物房適應性喂養7 d，隨后被隨機分成6組（n=7），分別為空白對照組（Con組）、酒精模型組（Mod組），三種益生菌分別聯合白藜蘆醇干預組（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Res組）、陽性藥物硫普羅寧組（LP組），所有組別小鼠均喂食普通飼料。實驗按照中國科學技術部動物管理條例，并經中國海洋大學食品科學與工程學院實驗動物倫理委員會批準（批準號：SPXY20200717）。

適應性喂養1周后，從第2周開始每天上午除Con組外其余組別小鼠均灌胃酒精（酒精濃度從20%（v/v）每3 d提高5%到終濃度40%，保持酒精濃度40%至11周末），Con組灌胃無菌蒸餾水，灌胃劑量均為10 mL/kg body weight。同時每天下午對小鼠以10 mL/kg body weight進行益生菌聯合白藜蘆醇及陽性藥物灌胃干預，白藜蘆醇在菌懸液中混勻并使最終干預劑量為50 mg/kg body weight，陽性藥物干預劑量為65 mg/kg/d，Con與Mod組以10 mL/kg body weight灌胃無菌PBS。灌胃至11周末處死小鼠。處死前12 h禁食，自由飲水。小鼠眼球靜脈取血，室溫放置30 min，3000 r/min離心15 min，小心吸取上層淡黃色血清分裝保存，同時收集肝臟組織均置于?80 ℃冰箱待用。

1.2.3 肝臟組織病理學分析 將小鼠肝左葉5 mm×5 mm固定在4%多聚甲醛中5~6 h，并常規進行石蠟包埋，從石蠟塊上切下一片厚度約為4 μm的肝臟組織切片，進行油紅O染色，并在顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.4 其它指標測定 按照廠家提供的說明，采用谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶測試盒檢測小鼠血清中AST、ALT活性。使用甘油三脂、總膽固醇、丙二醛、還原型谷胱甘肽、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶商業試劑盒及細胞色素酶CYP2E1ELISA試劑盒測定小鼠肝臟組織勻漿液中TG、TC、MDA、GSH含量及ADH、ALDH、SOD、CAT、CYP2E1活性。

1.2.5 RT-PCR檢測氧化應激相關基因的mRNA表達 利用RT-PCR檢測氧化應激相關基因CYP2E1、Nrf-2、HO-1的mRNA表達，引物序列如表1所示。根據試劑盒操作說明，稱取適量的肝臟組織，并加入trizol裂解液從組織中提取總RNA。通過逆轉錄試劑盒合成cDNA單鏈后進行qPCR操作。每個靶基因的檢測值與β-actin的比率代表每個靶基因的表達水平。ΔΔCt用于計算基因表達的倍數差異。

表1 逆轉錄聚合酶鏈反應的引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 數據處理

數據表示為平均值±標準差，使用SPSS Statistics 26.0進行數據分析。使用單因素方差分析（ANOVA）并進行S-N-K檢驗，P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 益生菌聯合干預對慢性酒精攝入導致的小鼠肝臟脂質積累的影響

研究發現，長期過量飲酒會導致機體脂質代謝紊亂，使肝臟中TG、TC含量顯著增加[13]。為了探討益生菌與Res聯合補充對慢性酒精喂養小鼠肝臟脂質積累的影響，采用組織學分析結合生化TG、TC測定來評價肝脂肪變性[14]。由圖1可知，與Con相比，Mod組小鼠肝臟脂質積聚增加，而聯合干預組脂質積累情況均得到改善。由圖2可知，益生菌聯合干預組及LP組的肝TG、TC含量均與Con組無顯著性差異（P>0.05），表明益生菌聯合干預組均能夠有效抑制慢性酒精喂養小鼠的脂質增加，其表現出的較強降脂活性與益生菌和Res本身具有的降脂活性密不可分，且兩者相互聯合的預防效果與LP組無顯著性差異（P>0.05），這對開發輔助降脂功能產品具有重要意義。

圖1 小鼠肝臟油紅O染色結果Fig.1 Oil red O staining of mice liver

圖2 益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠肝臟TG和TC含量的影響Fig.2 Effects of probiotics combined with resveratrol on TG and TC contents in mice liver

2.2 益生菌聯合Res干預對慢性酒精攝入導致的小鼠肝損傷的影響

AST和ALT被用作評估肝損傷的敏感指標[15]，酒精積累會破壞肝細胞膜的完整性和線粒體功能，促進AST和ALT的釋放[16?17]。由圖3可知，長期慢性飲酒導致Mod組小鼠血清AST和ALT活力較Con組小鼠顯著升高（P<0.05），但這種情況在所有預防干預組中均得到明顯改善；F1-7+Res和LP組小鼠血清AST和ALT水平均與Con組無顯著性差異（P>0.05），YRL577+Res組的AST水平及J5+Res組的ALT水平雖未處于正常水平但較Mod組分別降低了50.38%和30.20%。這表明各預防組均具有較好的預防慢性酒精性肝損傷的效果。

圖3 益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠血清AST和ALT活力的影響Fig.3 Effects of probiotics combined with resveratrol on serum AST and ALT activities in mice

2.3 益生菌干預對調節慢性酒精攝入小鼠酒精代謝酶活性的影響

ADH、ALDH和CYP2E1是肝臟參與酒精代謝的酶，但大量酒精攝入會導致CYP2E1發揮主要作用[18?19]，而CYP2E1被認為是誘導肝脂肪變性和氧化應激的重要因素[20]。從圖4結果可知，Mod組小鼠肝臟中ADH和ALDH活性均顯著降低，而CYP2E1活性卻顯著升高（P<0.05），但這一情況在四個預防干預組中得到改善，其中ADH活性在各干預組中不具有顯著性差異且與Con組同一水平（P>0.05），四個預防干預組（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Re、LP）ALDH活性分別是Mod組的2.23、2.34、1.80和1.71倍，同時，三個益生菌聯合干預組中CYP2E1活性與Con組不具有顯著性差異（P>0.05）且顯著優于LP組（P<0.05）。以上結果表明，益生菌聯合干預組能夠通過調控肝臟酒精代謝酶活力發揮對肝臟的保護作用。

圖4 益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠肝臟酒精代謝酶的影響Fig.4 Effects of probiotics combined with resveratrol on liver alcohol metabolizing enzymes in mice

2.4 益生菌聯合Res干預對慢性酒精攝入小鼠肝臟氧化應激和脂質過氧化水平的影響

酒精攝入會導致酶（如SOD、CAT）和非酶抗氧化劑（如GSH）過度消耗，誘發肝臟氧化應激反應[21],還會誘導肝細胞脂質自由基的形成和脂質的積累，從而導致脂質過氧化。MDA被用作氧化應激的生物標志物，以評估膜脂質過氧化的程度[22]。氧化應激和脂質過氧化均可增加酒精性肝損傷。圖5（a~c）結果顯示長期酒精攝入導致小鼠肝臟中SOD和CAT活性顯著降低，GSH大量減少（P<0.05），但這一情況在四個預防干預組中的得到顯著改善，其中，各干預組的SOD活性和GSH含量均與Con組無顯著性差異（P>0.05），各干預組的CAT活性雖未恢復至正常水平但均顯著高于Mod組（P<0.05）。同時為了評估脂質過氧化，測定了小鼠肝臟中的MDA含量。從圖5d可知，小鼠肝臟中MDA水平在各干預組中均不具有顯著性差異且與Con同一水平（P>0.05）。這些結果表明益生菌聯合干預組具有較強的抗氧化活性，能夠通過降低酒精導致的肝臟氧化應激和抑制脂質過氧化發揮對酒精性肝損傷的保護作用。

圖5 益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠肝臟氧化應激的影響Fig.5 Effects of probiotics combined with resveratrol on liver oxidative stress in mice

2.5 益生菌聯合Res干預對小鼠肝臟氧化應激相關基因mRNA表達的影響

Nrf-2、HO-1、CYP2E1均是調控肝臟氧化應激反應的關鍵基因[23]。Nrf2是一種轉錄因子，對于抑制氧化應激和維持細胞內穩態非常重要[24?25]，其在調節抗氧化基因表達方面起著關鍵作用，它的激活被認為是預防和治療與氧化損傷有關疾病的一個有吸引力的策略，包括急性和慢性肝損傷[26]。HO-1是Nrf2調控的下游基因，一種防御蛋白，通過催化血紅素降解保護細胞免受氧化應激損傷。從圖6可知，長期酒精暴露顯著抑制Nrf-2、HO-1基因并上調CYP2E1基因的表達（P<0.05）；益生菌聯合干預組及LP組均能顯著上調基因Nrf2 、HO-1mRNA表達，使之恢復正常，同時CYP2E1mRNA表達量（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Re、LP）也較Mod組分別下調45.0%、39.8%、34.8%和29.8%。以上結果表明益生菌聯合干預組可能通過調控Nrf-2、HO-1和CYP2E1基因的表達來改善機體的氧化應激狀態。

圖6 益生菌聯合白藜蘆醇對小鼠肝臟氧化應激相關基因mRNA表達的影響Fig.6 Effect of probiotics combined with resveratrol on mRNA expression of oxidative stress related genes in mice liver

3 討論與結論

本研究發現，益生菌聯合白藜蘆醇能夠顯著提高酒精喂養小鼠肝臟ADH、ALDH活性，并顯著抑制CYP2E1活性及基因CYP2E1的mRNA表達（P<0.05），這對轉變酒精氧化代謝途徑進而減少自由基產生具有重要意義。前人研究報道，藍莓聯合益生菌對酒精性脂肪性肝病具有協同保護作用，這與兩者聯合后具有的強大抗氧化活性有關[27?28]，但藍莓汁成分復雜，難以明確解釋其協同作用的分子機制。根據本團隊前期對緩解酒精性肝損傷的活性物質篩選結果，最終選擇白藜蘆醇與三株潛在功能性益生菌聯合作用。研究結果表明各益生菌聯合干預組均能顯著改善酒精導致的肝臟氧化和抗氧化失衡狀態，提高肝臟的抗氧化防御體系，提高肝臟GSH含量和SOD、CAT活性，降低MDA水平，并使部分指標恢復至正常水平，因此，聯合干預組表現出了強大的抗氧化能力，這對預防酒精導致的肝臟氧化應激具有重要作用。

Nrf2/HO-1通路是重要的內源性抗氧化應激通路，在維持機體抗氧化系統的生物學功能中起著不可或缺的作用[29]。酒精攝入會導致Nrf2/HO-1通路受到抑制[30]，這種抑制作用在所有益生菌聯合干預組中均得到顯著改善，因此，推測其可能通過調控Nrf2/HO-1通路預防酒精性肝損傷。然而，本研究僅初步檢測了Nrf2和HO-1的mRNA表達水平，接下來還需使用該信號通路的抑制劑或激活劑進行深入研究以驗證推測。

本研究利用C57BL/6J小鼠構建慢性酒精性肝損傷模型探究益生菌聯合白藜蘆醇對慢性酒精性肝損傷的保護作用及可能機制，實驗結果提示，益生菌聯合白藜蘆醇能夠顯著降低小鼠肝臟TG、TC含量和血清AST、ALT活性（P<0.05），提高肝臟酒精代謝酶ADH、ALDH活性并抑制肝臟CYP2E1活性及其mRNA表達，并增強肝臟抗氧化防御體系，使肝臟GSH含量和SOD、CAT活性顯著提高（P<0.05），并能有效激活Nrf2/HO-1通路，推測益生菌聯合白藜蘆醇通過Nrf2/HO-1途徑發揮對酒精性肝損傷的保護作用。綜上所述，益生菌聯合白藜蘆醇對慢性酒精性肝損傷具有很好的預防作用，這為解酒護肝功能性產品的開發利用提供參考，未來具有廣泛的應用前景。