運動疲勞小鼠皮層-紋狀體突觸可塑性受損的機制研究

馬 婧，陳慧敏，張凌韜，劉曉莉，喬德才

運動疲勞（exercise-induced fatigue，EF）在競技運動中普遍存在，它不僅嚴重影響運動員運動技能的執行，并且影響運動員的注意力和信息處理等認知功能（閆東旭等，2019）。長期運動疲勞導致神經肌肉功能下降，從而增加運動員的損傷風險（郭浩等，2021），并可能對其身心健康造成嚴重危害。因此，探究運動疲勞的中樞調控機制至關重要，但目前運動疲勞的發生或維持機制尚未被完全揭示。

皮層-紋狀體突觸可塑性被認為是隨意運動、運動技巧性學習以及習慣性行為的細胞機制（Di Filippo et al.，2009），運動技巧性學習能夠使人腦的突觸可塑性發生變化（劉展，2020；任占兵等，2019）。皮層-紋狀體突觸可塑性能夠調節基底神經節環路的功能，從而調控運動。其主要有兩種表現形式，即長時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程抑 制（long-term depression，LTD）。紋狀體同時接受皮層和丘腦的Glu能神經投射，以及黑質的DA能神經投射（Kreitzer et al.，2008；Kuhlmann et al.，2021），因此，皮層-紋狀體突觸可塑性同時受Glu能系統和DA能系統的調控。研究證實，皮層-紋狀體通路LTP依賴于通過NMDA受體內流的Ca2＋，以及NMDA受體和多巴胺1型受體（dopamine 1 receptor，D1R）的共同激活（Chepkova et al.，2012，2013）。而皮層-紋狀體通路LTD依賴于通過L型Ca2＋通道內流的Ca2＋，以及代謝型谷氨酸1型受體（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1）、多巴胺2型受體（dopamine 2 receptor，D2R）和大麻素1型（cannabinoid 1，CB1）受體的共同激活（Chepkova et al.，2012；Gubellini et al.，2004）。研究發現，運動能夠影響多巴胺能信號通路，增強多巴胺能系統的功能（馮俊鵬等，2019），并且多種運動功能障礙都與皮層-紋狀體的突觸可塑性異常有關，如亨廷頓舞蹈病（Huntington’s disease，HD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）和肌張力障礙（dystonia）等模式動物都表現出皮層-紋狀體通路的LTP和/或LTD受損（時凱旋 等，2021；Ghiglieri et al.，2019；Nouhi et al.，2017；Peterson et al.，2010）。運動疲勞后小鼠也會出現動作不協調、遲緩僵硬等行為表現，但鮮見關于運動疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性的變化研究。

前期利用場電位和膜片鉗技術研究發現，小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體的LTP和LTD均受損，紋狀體中型棘狀神經元（medium spiny neurons，MSNs）自發型興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs）的幅度不變，但sEPSCs的頻率升高，雙脈沖反應比值（paired-pulse ratio，PPR）降低，NMDA/AMPA電流比值降低（Ma et al.，2018）。這些結果表明，小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體通路的雙向突觸可塑性受損，突觸前Glu釋放的概率升高，AMPA受體的功能不變，但NMDA受體的功能降低。

由于皮層-紋狀體突觸可塑性受Glu能系統和DA能系統的雙重調控，因此，在前期研究發現運動疲勞小鼠皮層-紋狀體突觸可塑性受損的基礎上，本研究從Glu能系統和DA能系統入手，分別采用高效液相色譜分析（high performance liquid chromatography，HPLC）和免疫印跡（Western Blot）技術，檢測紋狀體腦區Glu、DA的濃度，以及Glu受體和DA受體的表達含量，以期進一步揭示小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

2月齡雄性C57BL/6小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）分籠飼養，自由進食飲水，自然光照，室溫（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。小鼠適應性飼養3天后，隨機分為對照組（Control，n=24）和運動疲勞組（EF，n=26）。

1.2 運動疲勞小鼠模型的建立

運動疲勞小鼠模型的創建方法同前期研究（馬婧等，2018）。首先，對小鼠進行連續3天的適應性跑臺訓練，15 min/天，跑臺速度為10 m/min。檢測每只小鼠的最大運動速度，檢測方法：小鼠以5 m/min的速度熱身運動3 min后，將速度提高至10 m/min運動1 min，隨后速度提高1 m/min，直到小鼠跟不上跑臺速度，持續退落至跑臺后方，該速度即為小鼠的最大運動速度。其次，進行連續7天的重復力竭跑臺運動：以5 m/min的速度熱身運動3 min后，將跑臺速度設定為小鼠最大運動速度的85%，以此速度使小鼠持續運動至力竭。力竭的判定標準：小鼠不能維持預定速度，長期滯留于跑道后方不動，使用手連續觸碰驅趕仍無效，并伴有呼吸急促、腹臥跑臺、垂頭不起等行為表現。Control小鼠暴露在相同的環境中，但不進行跑臺運動。

1.3 高效液相色譜分析實驗

1.3.1 小鼠紋狀體勻漿樣品制備

小鼠運動疲勞建模完成后即刻，對小鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉處死。冰浴中快速分離雙側紋狀體，以1∶10（組織質量/高氯酸體積）的體積比加入0.1 N的高氯酸，冰浴中勻漿，4℃14 000 r/min離心15 min后取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾，再次4℃14 000 r/min離心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱中保存待測。

1.3.2 柱前衍生熒光檢測法測定Glu濃度

稱取Glu標準品，利用0.1 N的高氯酸溶解分別配制濃度為10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L的Glu標準溶液。配制流動相A（0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液，pH 6.6）和流動相B（40%純甲醇）溶液，真空抽濾，超聲波震蕩脫氣。首先進行儀器管道的清洗，設定流動相的速度為1 mL/min，排空管內的氣體。調節流速為0.1～0.2 mL/min，連接色譜柱（QU-3C18-15021）和熒光檢測器（RF-20A），柱溫箱溫度設定為25℃，熒光檢測器的激發波長設為357 nm，發射波長設為455 nm。吸取20 μl的標準品溶液/樣品勻漿液，加入10 μl鄰苯二甲醛（OPA）衍生試劑和10 μl Na2CO3緩沖液，充分混勻后靜置30 s，微量進樣針抽取20 μl進樣到HPLC系統中檢測。

利用Glu標準品的不同濃度（10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L）及色譜中對應的峰面積，設標準品濃度為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，計算得到Glu的標準曲線方程。將小鼠紋狀體勻漿液色譜圖中與標準品具有相同保留時間（±0.1 s）的色譜峰的峰面積帶入標準曲線，從而計算小鼠紋狀體勻漿液中的Glu濃度。

1.3.3 電化學檢測法測定DA濃度

稱取DA標準品，利用0.1 N的高氯酸溶解，分別配制成10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L 的標準液。流動相 A：將0.09 mol/L二水合磷酸二氫鈉溶液、0.001 7 mol/L辛烷基磺酸鈉、0.05 mol/L一水合檸檬酸和50 μmol/L的EDTA混合后，利用磷酸將其pH調至3.0。流動相B：純甲醇（10%恒流洗脫），使用前經0.22 μm有機膜過濾，超聲波震蕩脫氣，設置流動相的速度為0.2 mL/min。采用QU-3C18-15021色譜柱，柱溫箱溫度設定為30℃，工作電壓0.52 V，靈敏度為0.1 nA。微量進樣針抽取20 μl的標準品溶液/樣品勻漿液進樣到HPLC系統中進行檢測。

利用DA標準品的不同濃度（10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L）及色譜中對應的峰面積，設標準品濃度為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，計算得到DA的標準曲線方程。將小鼠紋狀體勻漿液色譜圖中與標準品具有相同保留時間（±0.1 s）的色譜峰的峰面積，帶入標準曲線，從而計算小鼠紋狀體勻漿液中的DA濃度

1.4 免疫印跡實驗

小鼠運動疲勞建模完成后即刻，對小鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉處死。冰浴中快速分離紋狀體，利用膜蛋白提取試劑盒提取紋狀體膜蛋白。將蛋白質樣品置于95℃下，煮沸5 min，使蛋白變性。濃縮膠恒壓80 V電泳約30 min，待樣品進入分離膠后，恒壓110 V電泳約100 min。4℃恒流0.25 A的條件下，采用濕轉法轉膜3 h。隨后用5%脫脂奶粉-TBST室溫下封閉PVDF膜1 h。TBST洗3次，每次10 min。加入2.5%脫脂奶粉-TBST配置的各一抗溶液，4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min。5%脫脂奶粉-TBST配置辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶10 000，Sigma，R4880）室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min（馬婧等，2018）。利用化學發光法進行顯影定影，Quantity One軟件掃描目的蛋白以及內參的灰度值，將Control小鼠中目的蛋白與內參的比值標準化為100%，EF以與Control小鼠的比值表示。

目的蛋白和內參的一抗濃度及型號信息如下：GluR1，1∶1 000，Abcam ab109450；GluR2，1∶1 000，Abcam ab52932；mGluR1，1∶1 000，CST 12551S；D1R，1∶1 000，Abcam ab81296；D2R，1∶1 000，Millipore AB5084P；β-actin，1∶10 000，Sigma A2066）。

1.5 數據處理

所有數據均以Mean±SEM表示。利用Student’s t-test分析組間差異。雙側*P＜0.05定義為有統計學差異，**P＜0.01為差異顯著，***P＜0.001為差異極顯著。

2 結果

2.1 運動疲勞后小鼠紋狀體Glu能系統的變化

2.1.1 紋狀體Glu含量的變化

Glu標準品和小鼠紋狀體勻漿液的色譜圖如圖1所示。根據Glu標準品濃度（橫坐標x）和對應的色譜圖中峰面積（縱坐標y），計算得到Glu的標準曲線方程：y=369 845x＋1 406 929（R2=0.978 3）。統計結果顯示，與Control小鼠相比，EF小鼠紋狀體Glu的濃度增加［Control：（8.86±1.57）×10-6mol/L，n=7；EF：（14.23±1.33）×10-6mol/L，n=7；Student’s t-test，P＜0.05；圖2］，表明小鼠運動疲勞后紋狀體腦區Glu的含量增加。這與前期研究利用膜片鉗技術發現的運動疲勞后小鼠紋狀體突觸前Glu的釋放概率升高結果一致（Ma et al.，2018）。

圖1 Glu標準品和紋狀體勻漿液的高效液相色譜圖Figure 1.The HPLC Chromatograms of Glu Standards and Striatal Homogenates

圖2 運動疲勞組與對照組小鼠紋狀體Glu的濃度對比Figure 2.Comparison of Striatal Glu Concentration between EF and Control Mice

2.1.2 紋狀體Glu受體表達含量的變化

2.1.2.1 紋狀體AMPA受體表達含量的變化

AMPA受體是離子通道型Glu受體的一種，介導哺乳動物大腦中的快速興奮性突觸傳遞。AMPA受體在紋狀體腦區表達豐富，GluR1亞基和GluR2亞基是紋狀體AMPA受體的主要組成亞基，在MSNs和中間神經元中廣泛存在（Mao et al.，2013）。

利用Western Blot技術，檢測紋狀體膜蛋白中GluR1亞基和GluR2亞基的表達含量。結果顯示，EF小鼠紋狀體GluR1的表達含量與Control小鼠相比無差異［Control：（100.00±10.60）%，n=6；EF：（98.85±8.90）%，n=7；Student’s t-test，P＞0.05；圖3A、圖3B］，GluR2的表達也正常［Control：（100.00±5.07）%，n=7；EF：（98.93±4.57）%，n=7；Student’s t-test，P＞0.05；圖3C、圖3D］。EF小鼠紋狀體GluR1亞基和GluR2亞基的表達正常，提示，運動疲勞不影響紋狀體AMPA受體的表達。

圖3 運動疲勞組與對照組小鼠紋狀體GluR1、GluR2的蛋白表達比較Figure 3.Comparison of Expression of GluR1 and GluR2 in Striatum between EF and Control Mice

2.1.2.2 紋狀體mGluR1表達含量的變化

mGluR1為代謝型Glu受體的一種，已有研究證實，皮層-紋狀體LTD依賴于mGluR1（Gubellini et al.，2001）。因此，為了檢測mGluR1是否參與運動疲勞對小鼠皮層-紋狀體LTD的損害，利用Western Blot技術檢測了紋狀體mGluR1的表達含量。結果顯示，EF小鼠紋狀體膜蛋白中mGluR1的含 量 顯 著降低［Control：（100.00±9.88）% ，n=6；EF：（47.27±8.90）%，n=7；Student’s t-test，P＜0.01；圖4］。提示，小鼠運動疲勞后紋狀體mGluR1的表達下調，mGluR1的表達下調貢獻于運動疲勞對小鼠皮層-紋狀體LTD的損害。

圖4 運動疲勞組與對照組小鼠紋狀體mGluR1的蛋白表達比較Figure 4.Comparison of Expression of mGluR1 in Striatum between EF and Control Mice

2.2 運動疲勞后小鼠紋狀體DA能系統的變化

除了Glu能系統，皮層-紋狀體突觸可塑性也受DA能系統的調控。激活紋狀體DA能系統對于自主運動以及誘導皮層-紋狀體突觸可塑性均為必需（Centonze et al.，2003）。因此，為了探究運動疲勞是否還通過影響DA能系統，進而影響皮層-紋狀體突觸可塑性，本研究對運動疲勞后小鼠紋狀體DA能系統的變化也進行了探究。

2.2.1 紋狀體DA含量的變化

DA標準品和小鼠紋狀體勻漿液的色譜圖如圖5所示。根據DA標準品的濃度（橫坐標x）和對應的色譜圖中峰面積（縱坐標y），計算得到DA的標準曲線方程：y=114 473x＋248 273（R2=0.948 3）。結果顯示，與Control小鼠相比，EF小鼠紋狀體DA的濃度顯著降低［Control：（6.76±0.88）×10-6mol/L，n=5；EF：（2.36±0.90）×10-6mol/L，n=5；Student’s t-test，P＜0.01；圖6］，表明小鼠運動疲勞后紋狀體DA的含量降低。

圖5 DA標準品和紋狀體勻漿液的高效液相色譜圖Figure 5.The HPLC Chromatograms of DAStandards and Striatal Homogenates

圖6 運動疲勞組與對照組小鼠紋狀體DA的濃度對比Figure 6.Comparison of Striatal DAConcentration between EF and Control Mice

2.2.2 紋狀體DA受體表達含量的變化

紋狀體中DA受體主要有兩種類型，即D1R和D2R，兩者具有不同的作用。其中，D1R位于直接通路的MSNs中，對于誘導皮層-紋狀體LTP為必需，而D2R位于間接通路的MSNs中，對于誘導皮層-紋狀體LTD為必需（Calabresi et al.，2019）。

采用Western Blot技術，檢測兩組小鼠紋狀體膜蛋白中D1R和D2R的表達含量。統計顯示，EF小鼠紋狀體D1R的表達含量顯著降低［Control：（100.00±2.44）%，n=6；EF：（60.46±5.85）% ，n=7；Student’s t-test，P＜0.001；圖7A、圖7B］。并且，EF小鼠D2R的表達含量也顯著降低［Control：（100.00±5.45）%，n=6；EF：（54.70±7.85）%，n=7；Student’s t-test，P＜0.001；圖7C、圖7D］。提示，小鼠運動疲勞后紋狀體D1R、D2R的表達均下調，D1R的表達下調可能與皮層-紋狀體LTP受損有關，而D2R的表達下調可能與皮層-紋狀體LTD受損有關。

圖7 運動疲勞組與對照組小鼠紋狀體D1R、D2R的蛋白表達比較Figure 7.Comparison of Expression of D1R and D2R in Striatum between EF and Control Mice

3 討論

3.1 Glu能系統在運動疲勞損害皮層-紋狀體突觸可塑性中的作用

前期研究發現，EF小鼠MSNs的sEPSC頻率升高、PPR降低，兩者一致表明，小鼠運動疲勞后紋狀體突觸前Glu的釋放概率升高（Ma et al.，2018）。本研究采用HPLC技術進一步檢測紋狀體Glu的濃度，發現小鼠運動疲勞后紋狀體Glu的濃度升高。運動疲勞后，小鼠紋狀體Glu的含量以及釋放增多，提示，紋狀體接受來自皮層椎體神經元的興奮性Glu能神經投射增強。本研究認為，運動疲勞造成紋狀體Glu能神經投射增強，可能形成天花板效應，已經使突觸強度達到了飽和，因此給予皮層重復高頻刺激時，無法使突觸強度再進一步增強，從而抑制了皮層-紋狀體LTP的形成，這可能是運動疲勞后小鼠皮層-紋狀體LTP受損的分子機制之一。而且，紋狀體Glu能神經投射增強，Glu的過度累積也可能是直接導致皮層-紋狀體LTD受損的機制之一。

AMPA受體是紋狀體腦區介導快速興奮性突觸傳遞的一種離子通道型Glu受體（陳艷清等，2020）。采用Western Blot檢測紋狀體AMPA受體GluR1亞基和GluR2亞基的表達含量，發現EF小鼠紋狀體GluR1亞基和GluR2亞基的表達含量均正常，運動疲勞不影響紋狀體AMPA受體的表達。前期膜片鉗實驗結果顯示，EF小鼠sEPSCs的幅度正常（Ma et al.，2018）。由于記錄的sEPSCs為AMPA受體介導的突觸后電流，因此sEPSCs的幅度正常表示小鼠運動疲勞后紋狀體AMPA受體的功能正常。結合這兩項實驗結果，運動疲勞后紋狀體AMPA受體的表達含量和功能均未見改變，表明小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性的異常并非是由于AMPA受體異常導致的。

NMDA受體是另一種離子通道型Glu受體，NMDA受體的激活，以及通過NMDA受體內流的Ca2＋對于誘導皮層-紋狀體 LTP為必需（Kuhlmann et al.，2021；Shen et al.，2008）。前期實驗結果顯示，EF小鼠紋狀體NMDA/AMPA電流比值降低，提示，小鼠運動疲勞后紋狀體NMDA受體的功能下調（Ma et al.，2018）。NMDA受體的功能下調使內流的Ca2＋較少，胞內Ca2＋較低，不足以成功誘導LTP，這可能是運動疲勞損害皮層-紋狀體通路LTP的另一個原因。

mGluR1是一種代謝型Glu受體，皮層-紋狀體LTD依賴于mGluR1。本研究采用Western Blot檢測mGluR1的表達含量，發現EF小鼠紋狀體mGluR1的表達含量顯著降低。皮層椎體神經元釋放的Glu與紋狀體MSNs突觸后膜上的mGluR1結合，激活G蛋白，與通過L型Ca2＋通道內流的Ca2＋兩者共同作用，促使磷脂酰肌醇在磷脂酶C的作用下，經過一系列級聯反應，合成內源性大麻素2-AG（張凌韜等，2018）。釋放到突觸間隙后，2-AG逆行回突觸前膜，與突觸前膜上的內源性大麻素受體——CB1受體結合，激活CB1受體，繼而通過下游一系列分子的作用，最終減少突觸前Glu的釋放，形成內源性大麻素依賴的LTD（endocannabinoid-dependent LTD，eCB-LTD）（Robbe et al.，2002），這就是皮層-紋狀體eCB-LTD的形成過程。內源性大麻素2-AG的合成依賴于mGluR1。因此，本研究認為，運動疲勞后小鼠紋狀體mGluR1的表達下調造成內源性大麻素2-AG的合成減少，從而不利于突觸前Glu釋放的減少，使皮層-紋狀體LTD受損。前期研究發現，EF小鼠紋狀體CB1受體的表達上調（馬婧等2018），這可能是機體對于Glu過度積累、LTD受損做出的一種代償反應。

3.2 DA能系統在運動疲勞損害皮層-紋狀體突觸可塑性中的作用

除了接受來自皮層的Glu能神經投射，紋狀體還接受來自黑質的DA能神經投射（王炳蔚等，2016）。黑質DA神經元釋放DA，與紋狀體MSNs突觸后膜上的D1R和D2R結合。在背內側紋狀體微量注射D1R和D2R的拮抗劑，能夠顯著損害運動學習行為，提示，DA能系統在直接和間接通路上的調節作用為必需（Diao et al.，2021）。DA與D1R結合，激活D1R對于誘導皮層-紋狀體LTP為必需。使用D1R的拮抗劑或者D1R被敲除的小鼠紋狀體均不能成功誘導出 LTP（Kerr et al.，2001；Lovinger et al.，2003）。激活D1R后能夠增強環磷酸腺苷和蛋白激酶A的活性，從而促進LTP的產生（Miranda-Barrientos et al.，2014）。DA與D2R結合，激活D2R對于誘導皮層-紋狀體LTD為必需（Kreitzer et al.，2007）。DA能系統異常能夠損害皮層-紋狀體突觸可塑性。例如，在PD模式動物中，紋狀體DA能神經投射的缺失導致紋狀體LTP和LTD的雙向受損（Calabresi et al.，2007）。

為了探究運動疲勞后小鼠皮層-紋狀體LTP和LTD的受損，是否與DA能系統異常有關，本研究對運動疲勞后小鼠紋狀體的DA能系統進行了檢測。實驗結果顯示，EF小鼠紋狀體DA的濃度降低，D1R和D2R的表達含量也降低，提示，小鼠運動疲勞后紋狀體接受的DA能神經投射減少。這與侯莉娟等（2018）采用免疫組織化學染色觀察到的大鼠運動疲勞后D1R和D2R蛋白表達下調的結果一致。小鼠運動疲勞后，紋狀體接受的DA能神經投射減少，DA的含量降低，D1R的表達下調，可能是導致皮層-紋狀體LTP受損的分子機制之一；而紋狀體DA的含量降低，D2R的表達下調，可能是導致皮層-紋狀體LTD受損的分子機制之一。

李科等（2019）利用光遺傳技術激活DA能系統改善大鼠運動疲勞后紋狀體α和β頻段震蕩的異常，證實DA能系統在調控運動疲勞中發揮重要作用。前期研究發現，小鼠運動疲勞后MSNs的內在膜特性不變、突觸前Glu的釋放增多、NMDA受體的功能下調（Ma et al.，2018）。本研究進一步發現，小鼠運動疲勞后紋狀體DA能神經投射減少。這與已有研究報道的DA能神經投射缺失不影響紋狀體MSNs的內在膜特性，但是卻增加皮層-紋狀體突觸終末的Glu濃度和釋放（Calabresi et al.，1993；Lindefors et al.，1990），以及下調NMDA受體的功能（Steiner et al.，2010）相一致。提示，在正常的生理狀況下，內源的DA能神經投射對Glu能突觸傳遞起著負向的調節作用（余鋒 等，2020；Pisani et al.，2005）。因此，本研究認為，運動疲勞導致小鼠紋狀體DA能神經投射減少，DA含量降低，D1R和D2R的表達降低，DA能系統功能下調，進而引起紋狀體Glu的濃度和釋放增多、NMDA受體的功能降低，從而損害了小鼠皮層-紋狀體通路的LTP和LTD，造成了小鼠的運動功能障礙。

4 結論

探討小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的神經分子機制，發現小鼠運動疲勞后紋狀體Glu能系統出現異常，具體表現為Glu的含量增多，mGluR1的表達下調；小鼠運動疲勞后紋狀體DA能神經投射減少，DA能系統的功能下調，具體表現為DA的含量降低，D1R和D2R的表達下調。Glu能系統和DA能系統的雙重異常可能是導致小鼠運動疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的原因之一。