NIM811對(duì)Na2S2O4引起小鼠HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的研究

王 丹， 趙承軍， 陳桂生

腦缺血/再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，多種機(jī)制作用下最終導(dǎo)致神經(jīng)元等多種腦細(xì)胞凋亡、死亡[1]，它對(duì)腦組織的損傷比缺血本身造成的損害更嚴(yán)重[2,3]。迄今為止，對(duì)于腦缺血/再灌注損傷仍無(wú)有效的治療手段[4]。甲基-4-異亮氨酸環(huán)孢菌素(NIM811)是一種新型非免疫抑制性環(huán)孢菌素衍生物，它是環(huán)孢素A的同類(lèi)結(jié)構(gòu)藥物。前期實(shí)驗(yàn)表明NIM811具有降低谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的治療潛力[5]，但其在腦缺血再灌注中的研究未見(jiàn)報(bào)道。氧剝奪/復(fù)氧模型是一種常用的模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷的經(jīng)典方法[6]，因此，我們建立體外Na2S2O4引起小鼠H22神經(jīng)元氧剝奪/復(fù)氧模型[7]，探討NIM811是否對(duì)Na2S2O4引起小鼠H22神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，為研究治療缺血性腦卒中和腦缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞由寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，二氧化碳培養(yǎng)箱[HF240，力新儀器(上海)有限公司]；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(PowerWave XS2，美國(guó)Bio-tek公司)；倒置相差顯微鏡(07中地；CKX41，奧林巴斯)；倒置熒光顯微鏡及圖像采集(Ti-S，日本Nikon)；流式細(xì)胞儀(AccuriTM C6 Flow Cytometry，美國(guó)BD公司)；胎牛血清(BI，舜冉上海生物科技有限公司);CCK-8檢測(cè)試劑盒(日本同仁，北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司);Na2S2O4粉(純品，無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限司);NIM811(HY-P0025，MCE);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(KGA107，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司);活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(S0033，上海碧云天生物技術(shù)研究所);線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1(C2006，上海碧云天生物技術(shù)研究所);Rhod-2 AM鈣離子熒光試劑(ab142780，abcam)。

1.2 NIM811溶液的配置 將5 mg NIM811溶解于4.1576 ml DMSO中，配成1 mmol/L母液。再將1 mmol/L NIM811母液用DMEM培養(yǎng)基稀釋成600 nmol/L的工作液，分裝后冷凍于-20 ℃冰箱中。

1.3 細(xì)胞分組 將HT22細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組、Na2S2O4組、Na2S2O4+NIM811組、IM811組，正常對(duì)照組給予換液處理；Na2S2O4組給予含2 mmol/L Na2S2O4的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行缺氧1 h，然后更換為DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行復(fù)氧；Na2S2O4+NIM811組提前給予600 nmol/L NIM811預(yù)處理2 h，然后換為含有2 mmol/L Na2S2O4和600 nmol/L NIM811的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行缺氧1 h后，最后給予含有600 nmol/L NIM81的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)氧24 h；NIM811組在培養(yǎng)24 h后，給予含有600 nmol/L NIM811的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 按前面分組，以 5×103/孔的細(xì)胞密度接種96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組給予換液處理，各實(shí)驗(yàn)組按1.3述方法進(jìn)行處理。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 按前面分組以1.5×105/ml的細(xì)胞密度接種到6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養(yǎng)液，按照1.3的方法處理細(xì)胞后用胰酶消化、離心并收集細(xì)胞。進(jìn)行V-FITC/PI染色，室溫下避光孵育15 min后，置于冰浴，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.6 線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè) 按前面分組以1×105/ml的細(xì)胞密度接種到6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養(yǎng)液，按照1.3的方法處理細(xì)胞后用胰酶消化、離心并收集細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行JC-1染色，最后加入1 ml JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，置于冰浴，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè) 按前面分組以2×105/ml細(xì)胞密度接種在6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中，按照1.3處理各組細(xì)胞。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按DCFH-DA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，孵育結(jié)束后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 線(xiàn)粒體內(nèi)鈣離子濃度的檢測(cè)(Rhod-2) 以2×105/ml細(xì)胞密度接種在6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔2.5ml DMEM完全培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中，按照1.3處理各組細(xì)胞。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 Rhod-2 AM染色，孵育結(jié)束后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活性的影響 Na2S2O4組的細(xì)胞活性下降約46%(P<0.01)，在給予NIM811處理后，細(xì)胞活性有明顯增高38%(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

圖1 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞損后細(xì)胞活性的影響

2.2 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞凋亡率的影響 右上角為中晚期凋亡的細(xì)胞，右下角為早期凋亡的細(xì)胞，可以通過(guò)計(jì)算早期和中晚期細(xì)胞凋亡的總數(shù)來(lái)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。在對(duì)照組中，仍存在部分細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比2 mmol/LNa2S2O4組的細(xì)胞凋亡率明顯增高43%(P<0.01)；給予 NIM811處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯減少27%(P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

圖2 NIM811對(duì) Na2S2O4引起的 HT22細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后線(xiàn)粒體膜電位的影響 JC-1在正常細(xì)胞中，產(chǎn)生紅色熒光；在細(xì)胞凋亡時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光。圖中右上角代表紅色熒光所占百分比，右下角代表綠色熒光所占百分比，計(jì)算各組紅色熒光/綠色熒光的比值來(lái)比較各組膜電位的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Na2S2O4組細(xì)胞凋亡明顯增多，而給予NIM811處理后，紅色熒光明顯增多，凋亡減少，與Na2S2O4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

圖3 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞損傷后線(xiàn)粒體膜電位的影響

2.4 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后活性氧的影響 利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)。對(duì)照組中，有個(gè)別細(xì)胞熒光增強(qiáng)，說(shuō)明在正常狀態(tài)下有部分細(xì)胞活性氧水平較高；Na2S2O4組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞給予缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活性氧水平明顯增高；Na2S2O4+NIM811組中有個(gè)別細(xì)胞熒光增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧損傷并給予NIM811干預(yù)后，細(xì)胞活性氧水平明顯好轉(zhuǎn)，而NIM811組細(xì)胞熒光不明顯；給予NIM811處理后，Na2S2O4+NIM811組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較Na2S2O4組降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NIM811可以降低細(xì)胞的活性氧水平(見(jiàn)圖4)。

圖4 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞損傷后活性氧的影響

2.5 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后鈣離子濃度的影響 Rhod-2AM染色后觀察各組細(xì)胞的鈣離子熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，對(duì)照組有部分細(xì)胞熒光略強(qiáng)，與對(duì)照組比較，Na2S2O4組線(xiàn)粒體鈣離子熒光強(qiáng)度增高，說(shuō)明經(jīng)Na2S2O4損傷后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平增高。在給予NIM811干預(yù)后，Na2S2O4+NIM811組細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度比Na2S2O4組低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NIM811可以降低因Na2S2O4損傷引起的鈣超載水平(見(jiàn)圖5)。

圖5 NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞損傷后鈣離子水平的影響

3 討 論

目前已有研究證實(shí)NIM811可以減輕腦缺血后神經(jīng)損傷[8]。NIM811是否可以改善腦缺血再灌注損傷還沒(méi)有明確定論。本研究發(fā)現(xiàn)在給予NIM811處理前，Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活性下降約46%(P<0.01)；給予NIM811處理后，細(xì)胞活性增高38%(P<0.01)，說(shuō)明NIM811對(duì)Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活性有保護(hù)作用。即NIM811不僅可以減輕腦缺血后神經(jīng)損傷。并且NIM811沒(méi)有環(huán)孢素A的免疫抑制作用和毒性作用，其優(yōu)點(diǎn)是能透過(guò)血腦屏障[9]。

研究表明腦缺血再灌注損傷是一系列因素相互影響的結(jié)果，主要與鈣離子的負(fù)荷、線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)破壞與功能障礙、氧自由基理論、細(xì)胞凋亡、炎癥等有關(guān)[10～13]。在腦組織缺血期，以細(xì)胞壞死為主要表現(xiàn)形式，而在腦缺血再灌注過(guò)程中以細(xì)胞凋亡為主[14～16]。研究表明，線(xiàn)粒體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控發(fā)揮重要的作用[17,18]，主要是由于線(xiàn)粒體膜上的線(xiàn)粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放，釋放炎性介質(zhì)及氧自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，線(xiàn)粒體缺氧后還會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)，并導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，使得線(xiàn)粒體膜電位去極化[19]。這些事件的發(fā)生最終會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而加重腦組織損傷。目前認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷后，細(xì)胞內(nèi)鈣超載可以破壞線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)與功能[20,21]。本研究觀察到，在Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的細(xì)胞凋亡率明顯增高43%(P<0.01)，說(shuō)明在Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)存在細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象；給予 NIM811處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯減少27%(P<0.01)，說(shuō)明NIM811可以改善因Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的細(xì)胞凋亡，尤其是抑制細(xì)胞早期凋亡。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)觀察在Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)引起線(xiàn)粒體膜電位變化，活性氧增多，鈣超載現(xiàn)象。給予NIM811處理后，觀察到NIM811減輕了Na2S2O4引起的HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后引起線(xiàn)粒體膜電位超極化，抑制活性氧增多，減少鈣超載。證明NIM811可以提高Na2S2O4引起HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活性，推測(cè)在腦缺血再灌注時(shí)，NIM811可能與線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔上的親環(huán)蛋白D結(jié)合，阻斷線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔MTPT的開(kāi)放，保護(hù)受損的線(xiàn)粒體，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕神經(jīng)元的損傷。即對(duì)再灌注后神經(jīng)損傷也有保護(hù)作用。

綜上所述，NIM811對(duì)于HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后維護(hù)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)平衡和抑制細(xì)胞凋亡有重要的意義，這對(duì)未來(lái)研究治療缺血性腦卒中和腦缺血再灌注損傷的藥物時(shí)，NIM811作為一種候選藥物提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。