益腦康膠囊對腦缺血再灌注小鼠氧化應激損傷的作用研究?

彭麗霖， 鄧敏貞， 高志杰， 孫景波， 程 驍△

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院， 廣州 510120； 2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院， 廣州 510006；3.省部共建中醫濕證國家重點實驗室， 廣州 510120； 4.廣東省中醫急癥重點研究室， 廣州 510120)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是因腦部供血動脈發生堵塞導致腦組織壞死的一種常見腦血管疾病,其發病率、致死率與致殘率高，并發癥較多，嚴重者會危及生命[1]。推測到2030年，全球因該病所致的殘疾人數將超過2億人/年[2]。急性缺血性腦卒中治療主要包括溶栓和血管取栓，但存在腦出血轉化、腦水腫加重等并發癥，因此尋找有效的缺血性腦卒中保護療法是臨床亟待解決的問題。缺血性腦卒中的發病機制十分復雜，研究發現當大腦的脂質含量升高、耗氧量增加時產生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)會導致氧化應激反應，進一步引起神經細胞死亡[3]。氧化應激是缺血性腦卒中的重要病理機制之一，推測治療腦缺血損傷可以通過抑制氧化應激來實現。西醫主要使用組織型纖溶酶原激活劑治療缺血性腦卒中，但有發生腦出血等并發癥的風險[4]。中醫藥具有多靶點的治療優勢[5]，對缺血性卒中療效顯著[6，7]。

缺血性腦卒中屬于中醫學“中風”范疇。中醫理論認為患者平素氣血虧虛加之飲食失節、情緒失調及勞逸失度而誘發，其病機為本虛標實，病位在腦。益腦康膠囊主要由制天麻、川芎、制天南星、黃芪等組成，系廣東省名老中醫劉茂才經驗方，已制備成廣東省中醫院院內制劑，具有豁痰息風通竅、益氣活血通脈之功效[8，9]，臨床廣泛用于動脈粥樣硬化性急性缺血中風的治療。既往研究證明，益腦康膠囊具有減輕溶栓后血腦屏障破壞的作用[10]。同時益腦康可通過抑制動脈粥樣硬化性急性缺血中風大鼠腦組織血液中的細胞間黏附分子-1達到抑制炎癥反應的作用[11]。前期研究顯示，腦缺血損傷后腦內的NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)相關亞型NOX1、NOX2、NOX4參與氧化應激損傷過程[12，13]，醛糖還原酶(aldose reductase，AR)也參與腦缺血損傷后的氧化損傷過程[14]，但益腦康膠囊的抗氧化作用目前尚不明確。本研究通過觀察益腦康膠囊對缺血性腦卒中模型小鼠氧化相關分子AR及NOX1、NOX2、NOX4表達的影響，探討其作用機制。本研究經廣東省中醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理編號2019050。

1 材料

1.1 動物

75只SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量(20～25) g，12周齡，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物許可證號SCXK(蘇)2018-0008。飼養于廣東省中醫藥科學院實驗動物中心，提供SPF級小鼠顆粒飼料和滅菌后自來水自由飲食，飼養空間保持良好通風，動物飼養環境為(22±2)℃，相對濕度(45±5)%，光照時間為12 h。

1.2 藥物

益腦康膠囊由黃芪、川芎、制南星、制天麻、水蛭、半夏、益母草等組成，為廣東省中醫院院內制劑(批號180804)，由廣東省中醫院中心藥房制備。

1.3 主要試劑與儀器

腦中動脈缺血栓線(北京西濃科技有限公司，貨號1620A4)；氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，美國sigma公司，貨號T8877)；ROS、4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)和8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHDG)檢測試劑盒(南京草本源生物科技有限公司，貨號07/2018)；熒光定量PCR反轉錄試劑盒(日本TAKARA公司，貨號RR047A/RR086A)；BCA蛋白試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0009)；凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0012A)；ECL化學發光試劑(美國MERCK默克密理博公司，貨號WBKLS0500)；AR、NOX1、NOX2和NOX4抗體(美國abcam公司，貨號ab175394，ab131088，ab129068，ab109225)；二抗(美國abcam公司，貨號ab205718)。

勻漿機(艾卡儀器設備公司，型號T10)；冷凍離心機(德國艾本德公司，型號Centrifuge 5804 R)；全波長酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號EonC)；超微量紫外/可見光光度計(美國Thermo公司,型號Nanodrop2000)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號CFX96)；基礎電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號PowerPac Basic)；化學發光儀(美國Bio-Rad公司，型號ChemiDoc XRS+)。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機分為假手術組18只與造模組72只，采用大腦中動脈栓塞(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)法制備局灶性腦缺血再灌注模型，將造模成功的小鼠隨機分為模型組與益腦康低、中、高劑量組各18只。按照成人臨床有效劑量確定小鼠益腦康低(1 g/kg)、中(3 g/kg)、高(9 g/kg)劑量，造模成功后24 h按0.1 mL/10 g灌胃給藥，每天給藥2次，假手術組與模型組灌胃相應純水，連續治療3 d后取材。

2.2 造模方法

適應性飼養3 d后，小鼠禁食12 h，采用大腦中動脈栓塞(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)法制備局灶性腦缺血再灌注模型[4,15]。主要手術方法如下：異氟烷持續吸入麻醉小鼠，取俯臥位，去除顱骨表面組織，接入激光多普勒血流檢測儀，隨后取仰臥位平躺于手術顯微鏡下，行頸部正中切口，暴露右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，在距離 ECA 根部約 5 mm 處結扎 ECA，并在其根部放置結扎線打活結備用。提起頸總動脈，再用動脈夾夾閉頸內動脈，拉直頸外動脈，在頸外動脈遠心端剪一小口，邊松開動脈夾邊將一端加熱成圓珠狀線栓(線栓直徑為 0.2 mm)送入頸內動脈，以阻斷大腦中動脈的起始處血供，激光多普勒檢測大腦中動脈血流下降至20%，則提示大腦中動脈栓塞成功。于頸總動脈切口上方用絲線固定線栓，徹底止血逐層縫合肌肉和皮膚，將動物置于保溫箱中，栓塞1 h后將線栓取出完成再灌注。假手術組采用相同手術操作，不插入線栓。以小鼠手術麻醉清醒后出現左側肢體癱瘓、站立不穩、提尾時向一側轉圈為模型成功的判斷標準。

2.3 神經功能評分

假手術組與模型組于術后24 h，益腦康組于給藥結束后第2天參考Longa標準評分法進行小鼠神經功能評分[16]。其中無神經功能缺失，能自由行走和探索記為0分；不能完全伸展健側前肢記為1分；向健側轉圈出現追尾現象記為2分；行走時向右側傾倒記為3分；喪失意識且不能行走記為4分。

2.4 處死與取材

神經功能評分結束后，過量麻醉處死小鼠，剪開頭部皮膚及肌肉，暴露并剪開頭骨，取出全腦組織備測。

2.5 TTC染色檢測腦梗死體積

每組各取6只小鼠進行TTC染色。取小鼠大腦置于腦槽作冠狀切片，每片2 mm。把腦片放入2% TTC溶液中37 ℃水浴30 min，每15 min翻轉腦片1次。取出后洗去TTC拍照，用Image J圖像分析軟件測量腦梗死區域體積，計算梗死率。腦梗死率=(缺血對側半球體積-缺血側非梗死體積/)缺血對側半球體積×100%。

2.6 ELISA檢測缺血半暗帶區ROS、4-HNE、8-OHDG的含量

每組各取6只小鼠進行ELISA檢測。將各組缺血半暗帶區域組織精密稱重后，按1∶9(m∶v)加入0.9氯化鈉溶液，冰上電動勻漿數秒至均勻，冰水靜置5 min，使用冷凍離心機4 ℃ 3 000×g離心15 min，上清液置新EP管待用，按試劑盒說明書操作，檢測ROS、4-HNE、8-OHDG含量。

2.7 熒光定量PCR檢測缺血半暗帶區AR、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA表達

每組各取6只小鼠一半的缺血半暗帶區域組織進行熒光定量PCR檢測。采用Trizol試劑提取總RNA，使用Nanodrop檢測RNA純度和濃度。合成cDNA置PCR儀擴增，反應條件為: 95 ℃預變性5 s;PCR反應，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s循環40次。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算AR、NOX1、NOX2和NOX4的mRNA相對表達水平。引物序列：AR 上游：5′- CAGGCCGTTGGGGCTATTTA -3′，下游：5′- TCTTGGTGCCGTTGTTGAGT -3′，bp：119；NOX1 上游：5′- GTTTCTCTCCCGAAGGACCTC -3′，下游：5′- TTCAGCCCCAACCAGGAAAC -3′，bp：136；NOX2 上游：5′- CCCTCCCTGTCTAGGTAATGC -3′，下游：5′- GCATTTGCCTTCGGTGATGT -3′，bp：138；NOX4 上游：5′- ACCAAATGTTGGGCGATTGTG -3′，下游：5′- GATGAGGCTGCAGTTGAGGT -3′，bp：70；β-actin 上游：5′- CACTGTCGAGTCGCGTCC-3′，下游：5′- CGCAGCGATATCGTCATCCA-3′，bp：102。

2.8 Western Blot檢測缺血半暗帶區AR、NOX1、NOX2、NOX4蛋白表達

每組各取6只小鼠另一半的缺血半暗帶區域組織用于 Western Blot檢測。將組織放入離心管中，加入現配裂解液1 mL(含蛋白酶抑制劑10 μL)勻漿，冰上裂解10 min，取上清測定蛋白濃度，蛋白變性后以30 μg蛋白量上樣，80v電泳結束后濕轉至PVDF膜，轉膜后置5% BSA室溫封閉1 h，隨后加入AR、NOX1、NOX2、NOX4和GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，次日經TBST洗膜后加入對應的二抗室溫孵育1 h，洗膜后用ECL孵育，凝膠成像系統曝光拍照。以目的蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值比表示蛋白表達水平。

2.9 統計學方法

注：n=18。與假手術組比較：** P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；Sham：假手術組；Model：模型組；YNK：益腦康組圖1 各組小鼠神經功能缺損評分比較

3 結果

3.1 益腦康膠囊改善缺血性腦損傷小鼠神經功能評分

圖1示，假手術組神經功能評分為0，與假手術組比較，模型組的神經功能缺損評分顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，益腦康中、高劑量組神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。

3.2 益腦康膠囊減少腦缺血再灌注損傷后小鼠的腦梗死體積

圖2示，小鼠損傷側腦組織梗死灶呈白色，正常腦組織呈紅色。與假手術組比較，模型組的梗死體積顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，益腦康中、高劑量組腦梗塞體積顯著減少(P<0.05，P<0.01)，表明益腦康膠囊能降低腦缺血再灌注損傷后小鼠的腦梗死體積。

注：與假手術組比較：** P<0.01；與模型組比較：#P<0.05 ，##P<0.01；Sham：假手術組；Model：模型組；YNK：益腦康組圖2 各組小鼠腦梗死體積比較(n=6)

3.3 益腦康膠囊減少腦缺血再灌注損傷后過氧化損傷

圖3示，與假手術組比較，模型組的過氧化損傷標志物ROS、4-HNE和8-OHDG的表達顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，益腦康各劑量組ROS、4-HNE和8-OHDG的表達均明顯減少(P<0.05，P<0.01)，表明益腦康膠囊能減少腦缺血再灌注損傷后過氧化自由基損傷。

注：與假手術組比較：** P<0.01；與模型組比較：#P<0.05 ，##P<0.01；Sham：假手術組；Model：模型組；YNK：益腦康組ROS：reactive oxygen species,活性氧；4-HNE：4-Hydroxynonenal，4-羥基壬烯醛；8-OHDG：8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-羥基-2′-脫氧鳥苷。圖3 各組小鼠缺血半暗帶區域ROS、4-HNE和8-OHDG表達比較(n=6)

3.4 益腦康膠囊降低腦缺血再灌注損傷后AR及NOX1、NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達水平

圖4、5示，與假手術組比較，模型組AR、NOX1、NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，益腦康各劑量組AR、NOX1、NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達均顯著減少(P<0.05，P<0.01)，表明益腦康膠囊降低腦缺血再灌注損傷后AR及NOX1、NOX2、NOX4在mRNA和蛋白水平的表達。

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；Sham：假手術組；Model：模型組；YNK：益腦康組。AR：Aldose Reductase，醛糖還原酶；NOX：NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)oxidase，NADPH氧化酶圖4 各組小鼠缺血半暗帶區域AR、NOX1、NOX2、NOX4的mRNA表達比較(n=6)

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；Sham.假手術組；Model.模型組；YNK.益腦康組；AR.Aldose Reductase，醛糖還原酶；NOX.NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)oxidase，NADPH氧化酶圖5 各組小鼠缺血半暗帶區域AR、NOX1、NOX2、NOX4蛋白表達結果比較(n=6)

4 討論

ROS在氧化應激過程中發揮著重要作用。有證據表明，在急性缺血性中風后，ROS的迅速增加會造成進一步組織損傷，這些ROS可以破壞細胞大分子，導致細胞凋亡和壞死[17，18]。減少氧化應激損傷目前已成為保護缺血性卒中的主要手段之一。

西醫溶栓和機械取栓治療仍是治療缺血性腦卒中的主要手段，但溶栓受嚴格的時間窗限制。越來越多的研究表明，中醫藥治療在缺血性腦卒中后對神經血管單元的保護方面發揮了重要作用[19]。益腦康由黃芪、川芎、制天麻、制南星、益母草、制半夏、石菖蒲、全蝎等組成，具有益氣活血、息風滌痰的功效[11]。方中黃芪、川芎為君藥，其中黃芪補氣而不傷正，川芎活血祛瘀，為“血中之氣藥”，兩者合用達到氣旺血行、祛瘀而不傷正之目的；以制天麻、制南星息風滌痰為臣藥;益母草助川芎以活血化瘀，法半夏、石菖蒲助制南星以滌痰并能開竅醒神，全蝎助天麻、南星以息風止痙，以上共為佐使藥[20]。研究益腦康對缺血性卒中的保護作用及機制，可為益腦康膠囊的臨床應用提供實驗依據。

急性缺血性中風后，人體內脂質過氧化水平顯著增高。脂質過氧化過程中，脂氧酶激活過氧化物酶體增殖劑激活受體形成4-HNE，增加骨組織ROS的產生[21]。研究報道，8-OHDG是氧化修飾的產物,8-OHDG的測定可作為預測早期腦血管事件的有效指標[22]。AR是多元醇代謝途徑的限速酶，研究報道脂質過氧化會產生有毒的醛類如4-HNE，而AR可以將其還原為相應的無毒醇，從而發揮抗氧化應激的作用[23，24]。通過實驗結果可知，缺血性腦卒中模型小鼠的氧化應激程度比較高，表現在ROS、4-HNE和8-OHDG表達增加，AR表達增多，益腦康干預后小鼠的ROS、4-HNE和8-OHDG表達有所減少，AR表達減少說明益腦康對缺血性模型小鼠的氧化應激過程產生了一定的抑制作用。

研究報道，細胞ROS的重要來源包括NOX、NOX是進化上保守的多亞基跨膜蛋白，NOX介導的ROS調節多種生物過程，包括激素合成、鈣信號傳導、細胞遷移和免疫[25]。中樞神經系統在發育和成年期均表達不同的NOX亞型，其中NOX1、NOX2和NOX4都與神經系統有關[26]。本實驗結果顯示，缺血性卒中模型小鼠的NOX1、NOX2和NOX4表達顯著增多，通過益腦康干預后，NOX1、NOX2和NOX4表達較少，說明益腦康對缺血性卒中模型小鼠的抗氧化作用靶點可能與NOX有關。

綜上所述，益腦康對缺血性卒中模型小鼠具有一定的神經保護作用，其機制可能與調節AR/NOX氧化軸對抗神經損傷有關，本研究可為益腦康應用于臨床提供一定的實驗依據。