煙嘧磺隆降解菌Chryseobacterium sp. LAM-M5的分離、鑒定及其降解機(jī)理研究

馬青云 江旭 李情情 宋金龍 周義清 阮志勇，4，5

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/CAAS-CIAT可持續(xù)農(nóng)業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；4. 西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，林芝 860000；5. 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264005）

化學(xué)除草劑在保障糧食產(chǎn)量和質(zhì)量方面發(fā)揮了重要的支撐作用。然而，中國(guó)作為除草劑生產(chǎn)和使用大國(guó)，每公頃農(nóng)田中除草劑的平均使用量為世界平均水平的 1.5-4 倍［1］，除草劑殘留正成為限制中國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的瓶頸問題之一［2］。磺酰脲類除草劑屬于高效、低毒、高選擇性的新型除草劑，被廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、大豆等田間雜草的防控，其用量也逐年遞增［3］。2015 年全世界磺酰脲類除草劑的銷售額已達(dá)20.19億美元，占整個(gè)除草劑市場(chǎng)的11.0%［4］。煙嘧磺隆是磺酰脲類除草劑的代表性品種（圖1），年銷售額達(dá)2.82億美元［5］，由于其淋溶性較強(qiáng)，易對(duì)土壤及地下水造成污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在的威脅［6-8］，同時(shí)影響輪作和后茬敏感作物，并危害水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

圖1 煙嘧磺隆化學(xué)結(jié)構(gòu)式［3］Fig.1 Chemical structural formula of nicosulfuron

煙嘧磺隆在自然環(huán)境中可通過化學(xué)水解［9］、微生物代謝［10］和光催化實(shí)現(xiàn)降解［11］。微生物代謝降解是實(shí)現(xiàn)煙嘧磺隆從環(huán)境中去除的最主要過程，也是最有效和環(huán)境友好的途徑。迄今為止，已經(jīng)從農(nóng)田土壤、工廠排污口、河流、活性污泥等多個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中分離出了多個(gè)煙嘧磺隆降解菌株。Zhao 等［12］從磺酰脲類除草劑污染的農(nóng)田土壤中分離得到的糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）ZWS11，在6 d內(nèi)對(duì)初始質(zhì)量濃度為 500 mg/L的煙嘧磺隆的降解率達(dá) 80% 以上。代鵬飛等［13］從農(nóng)藥廠的活性污泥中分離到一株能以煙嘧磺隆為唯一碳源生長(zhǎng)的假單胞菌（Pseudomonas）YN-8，在7 d內(nèi)對(duì)100 mg/L 的煙嘧磺隆降解率為65.4%。張國(guó)民等［14］從玉米田土壤中分離到一株紅假單胞菌（Rhodopseudomonas），在7 d內(nèi)對(duì)400 mg/L的煙嘧磺隆降解率為32.3%。Wang等［15］從人工濕地土壤中分離得到的克雷伯氏菌（Klebsiella）Y1，在 6 d內(nèi)對(duì)100 mg/L的煙嘧磺隆降解率為78.90%。Carles等［16］從煙嘧磺隆污染的農(nóng)田土壤中分離到一株（Pseudomonas fluorescens）SG-1，在1 d內(nèi)對(duì)2.5 mg/L的煙嘧磺隆降解率為77.5%。此外，研究人員還分離到了具有煙嘧磺隆降解能力的真菌，例如，F(xiàn)eng等［17］從活性污泥中分離到一株青霉菌（Penicillium）YC-WC1，在6 d內(nèi)能完全降解100 mg/L的煙嘧磺隆。許多研究人員從降解菌株中發(fā)現(xiàn)了多種降解相關(guān)的功能基因及酶，例如，李順鵬等［18］從嗜甲基菌（Methylophilussp.）S113 菌株中獲得了噻吩磺隆水解酶基因tsmE，該基因的表達(dá)產(chǎn)物在1 h 內(nèi)能夠?qū)?00 mg/L 的噻吩磺隆完全水解。Ruan等［19］對(duì)庫(kù)特氏屬（Kurthia huakuii）LAM0713菌株克隆得到一個(gè)新的酯酶基因sue，該基因的表達(dá)產(chǎn)物在 15 min 內(nèi)對(duì)50 mg/L的醚磺隆降解率達(dá)43.2%。宋金龍［20］從黃籃狀菌（Talaromyces flavus）LZMl中純化得到的黃素單加氧酶fmo，在15 min內(nèi)對(duì)50 mg/L煙嘧磺隆的降解率達(dá) 71.7%。

目前已報(bào)道的煙嘧磺隆降解菌的多樣性十分有限，僅集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等幾個(gè)屬中，難以滿足不同環(huán)境條件下煙嘧磺隆污染的生物修復(fù)需求，因此，有必要從不同環(huán)境樣品中分離得到更多更豐富的煙嘧磺隆降解菌資源，并進(jìn)行功能評(píng)價(jià)及降解機(jī)理研究。本研究從合肥某煙嘧磺隆生產(chǎn)廠的活性污泥中分離并篩選得到一株能以煙嘧磺隆為唯一氮源生長(zhǎng)菌株，對(duì)其進(jìn)行分類鑒定和降解機(jī)理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產(chǎn)廠廢水處理池的活性污泥，采集后裝入滅菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于煙嘧磺隆降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑 煙嘧磺隆（分析純，＞ 95%）購(gòu)自上海阿拉丁有限公司，Taq DNA 聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物購(gòu)自博邁德有限公司，乙腈（色譜純）等有機(jī)試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 GSM培養(yǎng)基：5.0 g葡萄糖，0.2 g NaCl，0.1 g CaCl2，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0，無 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基：1.0 g Na3HPO4·12H2O，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0。在115℃條件下高壓滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g瓊脂，1 000 mL水，pH 7.4-7.6，121℃條件下高壓滅菌20 min，液體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 煙嘧磺隆降解菌的富集與篩選 取10 g污泥樣品添加到100 mL含終濃度為50 mg/L的煙嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/mim的搖床上避光培養(yǎng)30 d，然后以5%的接種比例將該體系轉(zhuǎn)接至100 mL含150 mg/L煙嘧磺隆的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每次提高煙嘧磺隆濃度50 mg/L，并使煙嘧磺隆終濃度達(dá)到200 mg/L。馴化3個(gè)月后將培養(yǎng)液用無菌水進(jìn)行倍比稀釋后涂布到含50 mg/L煙嘧磺隆的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上。將出現(xiàn)的菌落劃線純化后放置- 80℃冰箱保藏備用。

1.2.2 煙嘧磺隆降解菌的初步鑒定 將獲得菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng) 2 d后觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。將菌株接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中并置于30℃，160 r/mim的搖床上培養(yǎng)過夜，利用DNA提取試劑盒提取菌液DNA，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用細(xì)菌通用引物1492R和27F擴(kuò)增該菌株中的16S rRNA基因［21］，純化的PCR產(chǎn)物由北京博邁德測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：模板DNA 1 μL；正向及反向引物各 1 μL；Taq PCR Mix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL。PCR 程序如下：95℃，初始變性 5 min；95℃，變性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 1.5 min，循環(huán) 30 次；72℃，延伸 10 min。將測(cè)序結(jié)果提交至EzBioCloud［22］進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選擇相似性高的菌株作為參比并下載相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列，通過 CLUSTAL X［23］進(jìn)行多序列比對(duì)，使用MEGA7.0［24］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定該菌的分類地位。

1.2.3 菌株降解性能測(cè)定 將菌株LAM-M5接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30℃，165 r/min的恒溫?fù)u床上避光培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄上清，收集菌體。用0.13mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）洗滌菌體3次后重懸，以5.0%（V∶V）接種比例接入含終濃度50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中，于30℃、165 r/min條件下避光培養(yǎng)，研究降解菌對(duì)煙嘧磺隆的降解效果，以未接種的相同體系作為空白對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定期取樣檢測(cè)液體培養(yǎng)基中煙嘧磺隆殘留量。

煙嘧磺隆的測(cè)定采用高效液相色譜法［25］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積外標(biāo)法定量。本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1200 LC高效液相色譜：色譜柱：Dikam Diam onsil C18，柱長(zhǎng) 250 mm×4.6 mm，內(nèi)徑5 μm；柱溫：30℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈∶水∶冰乙酸 =（30∶70∶0.05，V∶V∶V）；進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。根據(jù)公式計(jì)算降解能力：降解率/% =［1 -（實(shí)測(cè)殘量/對(duì)照樣實(shí)測(cè)殘量）］× 100%［26］。

1.2.4 菌株降解煙嘧磺隆的特性研究 菌株的降解特性研究包括菌株在不同溫度、pH及接種量條件下對(duì)煙嘧磺隆的降解能力。設(shè)置不同溫度（15、20、25、30和35℃），不 同pH值（5、6、7、8和9）和不同接種量（0.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，V∶V），將菌株接種至不同條件下含煙嘧磺隆GSM培養(yǎng)基中作為處理組，以相同條件下不接入菌株為對(duì)照組，測(cè)定煙嘧磺隆殘余濃度計(jì)算菌株的降解率。

1.2.5 短鏈有機(jī)酸的鑒定 利用HPLC檢測(cè)并鑒定菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸情況，檢測(cè)條件：流動(dòng)相為磷酸二氫銨（0.02 mmol/L，pH 2.7）與甲醇的混合物（比例為85∶15，V∶V），進(jìn)樣量為10 μL，光電二極管陣列檢測(cè)器的波長(zhǎng)為210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。以分析純級(jí)的草酸、L -蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和富馬酸作為參照標(biāo)樣。

1.2.6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆中間產(chǎn)物的檢測(cè) 將菌株LAM-M5按1.2.3的方法培養(yǎng)并制備OD600為1.0的菌懸液。取5.0%的LAM-M5菌懸液接種到含有50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基，以相同條件但不接菌的GSM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)3 d后取樣，上述所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。使用配備電噴霧電離的Xevo三重四極桿（Xevo-TQD）質(zhì)譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)量模式m/z為100-450［27］，Masslynx NTV的正模式（ESI +）和負(fù)模式（ESI -）的ESI源被用于收集和分析獲得的數(shù)據(jù)［28］。

1.2.7 菌株LAM-M5全基因組測(cè)序及分析 將菌株LAM-M5送至諾禾致源科技有限公司（北京，中國(guó)）進(jìn)行基因組測(cè)序，具體流程參考文獻(xiàn)［29］。菌株全基因組測(cè)序完成后，分析菌株的基因組成分，分析預(yù)測(cè)編碼基因、非編碼 RNA、重復(fù)序列、CRISPR 等基因組成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼基因序列進(jìn)行功能注釋。結(jié)合已報(bào)道降解相關(guān)的基因，搜索并分析該菌株中可能存在的與煙嘧磺隆降解相關(guān)的功能基因信息。

2 結(jié)果

2.1 煙嘧磺隆降解菌株的分離

將富集培養(yǎng)得到的富集液進(jìn)行煙嘧磺隆的降解驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)富集液對(duì)煙嘧磺隆幾乎無降解作用，接下來對(duì)富集液進(jìn)行平板稀釋涂布，共獲得18株細(xì)菌，其中菌株LAM-M5的降解能力最強(qiáng)，在GSM培養(yǎng)基中7 d（30℃，5%接種量）對(duì)50 mg/L的煙嘧磺隆的降解率可達(dá)92.39%，選作后續(xù)研究菌株。

2.2 煙嘧磺隆降解菌株的鑒定

菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈金黃色，不透明（圖2）。革蘭氏陰性，無鞭毛。

圖2 菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain LAM-M5 on the beef extract peptone medium plate

將菌株LAM-M5的16S rRNA基因序列（1 505 bp）提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中（序列登錄號(hào)為：MW647553）。將該基因序列信息在EzBiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，LAM-M5的16S rRNA基因序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T相似性最高，達(dá)到99.93%。利用 NJ（neighbor joining method）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，菌株LAM-M5與來自Chryseobacterium屬的菌株聚在一起，因此，初步將該菌株鑒定為Chryseobacteriumsp. LAM-M5。自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載菌株Chryseobacterium lacusYLOS41T的全基因組信息，通過OrthoANIu algorithm（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）分析菌株間的平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）。結(jié)果表明，菌株LAM-M5的基因組序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T的ANI值是97.74%，利 用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http://ggdc.dsmz.de/）計(jì)算菌株間的DNA雜交同源性（DNA-DNA hybridization，DDH），菌株LAM-M5與Chryseobacterium lacusYLOS41T間的DDH值為79%，兩個(gè)數(shù)值均高于定義同種的閾值（ANI 95%-96%和DDH 70%）［30］，因此將該菌株LAM-M5鑒定為Chryseobacterium lacus，這是首次關(guān)于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）菌株降解煙嘧磺隆的報(bào)道。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 煙嘧磺隆的降解特性

LAM-M5可以在較寬的pH值范圍（5-9）內(nèi)降解煙嘧磺隆（圖4-A），降解率隨pH值的降低而增加。初始pH值為6.0時(shí)，菌株LAM-M5對(duì)煙嘧磺隆的降解效果最佳，可達(dá)92.39%。在第3天時(shí)，開始對(duì)50 mg/L煙嘧磺隆表現(xiàn)出明顯的降解，此時(shí)體系pH值開始下降；第7天時(shí)，體系pH值降至3.5，此時(shí)菌株LAM-M5對(duì)50 mg/L的煙嘧磺隆降解率達(dá)到92.39%。菌株LAM-M5對(duì)溫度具有較好的適應(yīng)性，它在15℃-35℃范圍內(nèi)均能降解煙嘧磺隆，且降解效率隨溫度增加而增加（圖4-B），在35℃時(shí)降解效果最佳，達(dá)到98.39%。菌株LAM-M5的初始接種量對(duì)煙嘧磺隆的降解率也有影響，隨著接種量的增加，降解效率有明顯的增加，初始接種量為10% 時(shí)，降解效率最高，達(dá)到99.6%。

圖4 不同pH值（A）、溫度（B）、接種量（C）對(duì)菌株LAM-M5 降解煙嘧磺隆降解率的影響Fig.4 Effects of different pH（A），temperature（B）and initial inoculum ratio（C）on the degradation of nicosulfuron by strain LAM-M5

同時(shí)驗(yàn)證了菌株LAM-M5對(duì)其他田間常用除草劑的降解，例如，磺酰脲類除草劑氯嘧磺隆和三酮類除草劑硝磺草酮，在相同的培養(yǎng)條件和降解體系內(nèi)，菌株LAM-M5對(duì)這兩類除草劑在7 d內(nèi)均無降解。

2.4 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸的鑒定

本研究中，菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，體系pH值在7 d之內(nèi)從7.0降至3.0左右（圖5）。利用HPLC對(duì)菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行了檢測(cè)，在培養(yǎng)液中檢測(cè)到了大量L -蘋果酸，由于煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩(wěn)定，推測(cè)菌株LAM-M5通過代謝葡萄糖產(chǎn)生大量L-蘋果酸，降低環(huán)境pH值，從而使煙嘧磺隆發(fā)生脲橋斷裂而降解。

圖5 LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中pH值的變化Fig.5 Change of pH value during the nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.5 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆代謝產(chǎn)物的檢測(cè)及其代謝途徑的推測(cè)

通過高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用［31］，對(duì)菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)與分析。ESI源檢測(cè)結(jié)果表明，在陰離子和陽(yáng)離子模式下，共檢測(cè)到5個(gè)片段，質(zhì)荷比分別為409m/z，259m/z，228m/z，156m/z，304m/z。根據(jù)已報(bào)道的代謝途徑及中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)［31-33］，對(duì)檢測(cè)片段的物質(zhì)類型和產(chǎn)生途徑進(jìn)行了推斷，其中陰離子模式中的259.44m/z（2-（N-氨基甲酰磺酰磺酰基）- N，N-二甲基丙酰胺）是由于磺酰脲橋C-N鍵的斷裂產(chǎn)生，并進(jìn)一步斷裂酰胺鍵產(chǎn)生228.38m/z（2-氨基磺酰基-N，N-二甲基丙酰胺）。陽(yáng)離子模式下質(zhì)荷比為304.18m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）的產(chǎn)生是由于煙嘧磺隆中吡啶環(huán)的開環(huán)［34］；在陽(yáng)離子模式下檢測(cè)到的155.41m/z（2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶）產(chǎn)物是由304.18m/z產(chǎn)物的磺酰脲橋的酰胺鍵斷裂產(chǎn)生。綜上，推測(cè)得出了菌株LAM-M5在GSM培養(yǎng)基中對(duì)煙嘧磺隆可能的降解途徑（圖6）。

圖6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆的代謝途徑Fig .6 Proposed metabolic pathways of nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.6 菌株LAM-M5基因組分析

2.6.1 菌株LAM-M5基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析 通過對(duì)菌株LAM-M5的基因、重復(fù)序列、非編碼 RNA 等的預(yù)測(cè)，獲得了該菌株基因組的組成基本情況信息（表1）。菌株LAM-M5的基因總長(zhǎng)度為5.704 Mb，基因組中含基因數(shù)量達(dá)6 366個(gè)，平均長(zhǎng)度 896 bp。串聯(lián)重復(fù)序列共 280個(gè)，總長(zhǎng)為 17 086 bp，占基因組全長(zhǎng)的 0.2707%。小衛(wèi)星序列 211個(gè)，微衛(wèi)星序列 0個(gè)，tRNA 121個(gè)，rRNA 14個(gè)。

表1 LAM-M5的基因組組分結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Genomic characteristics of strain LAM-M5

2.6.2 菌株LAM-M5對(duì)煙嘧磺隆降解酶基因的預(yù)測(cè) 在該研究中，對(duì)菌株LAM-M5進(jìn)行基因組Swiss-port的數(shù)據(jù)庫(kù)分析，同時(shí)結(jié)合已報(bào)道的煙嘧磺隆的降解基因分析，對(duì)菌株LAM-M5中可能參與煙嘧磺隆降解的相關(guān)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株LAM-M5 基因組中7個(gè)降解酶相關(guān)的基因Table 2 7 genes related to degradation enzymes in the genome of strain LAM-M5

3 討論

煙嘧磺隆長(zhǎng)期使用造成的殘留會(huì)對(duì)土壤及地下水造成污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在的威脅，同時(shí)損害后茬敏感農(nóng)作物，并危害水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此尋找高效、環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)的除草劑污染環(huán)境治理方法十分迫切。微生物修復(fù)技術(shù)無毒、無殘留，避免了二次污染，是消除煙嘧磺隆殘留及保障農(nóng)產(chǎn)品安全的有效途徑之一。目前已經(jīng)從各種環(huán)境樣本中通過富集馴化等方式獲得了許多煙嘧磺隆的降解資源。但是這些降解資源僅限于環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)屬，例如芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）等。環(huán)境中存在著豐富的微生物資源，許多具有降解功能的菌株資源未被發(fā)掘，可嘗試通過培養(yǎng)組學(xué)［35］的方法獲得更多的煙嘧磺隆降解的菌株資源，豐富除草劑的微生物降解資源庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)從某煙嘧磺隆生產(chǎn)廠的活性污泥中，分離出一株煙嘧磺隆高效降解菌株LAM-M5，通過16S rRNA的基因序列比對(duì)，初步將菌株鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5。

在已報(bào)道的煙嘧磺隆微生物降解途徑與相關(guān)機(jī)制中，煙嘧磺隆主要通過脲橋上的C-N鍵斷裂完成降解。Zhao等［12］在糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalisZWS11）對(duì)煙嘧磺隆的降解產(chǎn)物中檢測(cè)到了N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，并由此推斷這兩個(gè)降解產(chǎn)物是由磺酰脲橋的C-N鍵斷裂直接得到的。Zhang等［36］根據(jù)粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensN80）對(duì)煙嘧磺隆的主要降解產(chǎn)物推測(cè)了其降解途徑，其中化合物N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶均是在微生物作用下直接從煙嘧磺隆獲得，分別來自于磺酰脲橋上 C-N 鍵的斷裂。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，不同種類微生物對(duì)煙嘧磺隆的降解途徑均存在差異，并導(dǎo)致所產(chǎn)生的中間降解產(chǎn)物有所不同［37］，但是幾乎所有的煙嘧磺隆降解體系中都能直接檢測(cè)到產(chǎn)物N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，表明這兩種化合物是在微生物作用下直接由煙嘧磺隆產(chǎn)生的。但是在本研究中，檢測(cè)到的2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶并不能在菌株LAM-M5的作用下直接獲得，而是由中間產(chǎn)物N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）酰胺鍵斷裂后生成的。表明菌株LAM-M5對(duì)煙嘧磺隆的降解過程和機(jī)制不同于糞產(chǎn)堿桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌。

在以前的報(bào)道中，對(duì)黃籃狀真菌（Talaromyces flavusLZM1）［21］和臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［32］降解煙嘧磺隆的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了比較深入的研究。這兩個(gè)菌在降解煙嘧磺隆過程中均能直接產(chǎn)生259.44 m/z（2-氨基磺酰基-N，N-二甲基煙酰胺），304.18 m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）和另外一個(gè)346m/z（2-（1-（4，6-二甲氧基-嘧啶-2-）-脲基）-N，N-二甲基-煙酰胺）產(chǎn)物，說明這兩個(gè)菌均能通過3種途徑降解煙嘧磺隆。而在本研究中，雖然我們嘗試不同時(shí)間取樣和改變檢測(cè)條件，但是346 m/z這個(gè)產(chǎn)物卻始終檢測(cè)不到，說明菌株LAM-M5對(duì)煙嘧磺隆的降解過程和機(jī)制不同于黃籃狀真菌和臘狀芽孢桿菌。

同時(shí)監(jiān)測(cè)到該菌株與煙嘧磺隆共培養(yǎng)過程中，體系的pH值從7.0減少到3.0，環(huán)境酸化，而煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩(wěn)定，從而造成煙嘧磺隆的脲橋發(fā)生斷裂，推測(cè)這可能是一種微生物自我保護(hù)機(jī)制。通過對(duì)菌株的全基因組信息分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的基因序列中含有大量已報(bào)道的參與煙嘧磺隆降解過程的功能基因，如水解酶［19］、氧化酶［37］、酯酶［38］、過氧化氫酶［39］等。

4 結(jié)論

從活性污泥中獲得了一株煙嘧磺隆的高效降解菌，初步鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5，該菌最適的降解條件為35℃，pH 6.0，接種量10%時(shí)菌株對(duì)50 mg/L的煙嘧磺隆降解率最高可達(dá) 92.39%。菌株在以葡萄糖為碳源時(shí)，通過產(chǎn)生大量的L-蘋果酸導(dǎo)致體系內(nèi)pH值下降，造成煙嘧磺隆脲橋斷裂。菌株Chryseobacterium lacusLAM-M5對(duì)煙嘧磺隆具有較高的降解能力。