BbRho5對球孢白僵菌生長速率的作用研究

關怡 李新 王定一 杜茜 張龍斌 葉秀云

（1. 福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室，福州 350108；2. 福建師范大學地理科學學院，福州 350007；3. 福建農林大學植物保護學院，福州 350002）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是當前世界上研究和應用最廣泛的生防真菌之一，已被開發成為多種制劑用于農林害蟲的生物防治［1-2］。作為典型的絲狀昆蟲病原真菌，良好的菌絲生長狀態是保證球孢白僵菌完整、穩定完成生活史及宿主侵染的重要前提。因此，對影響球孢白僵菌菌絲生長的功能基因研究多年來仍方興未艾。

Rho蛋白是一類小GTP酶（small GTPase），歸屬于Ras蛋白超家族（Ras superfamily），在細胞中作為保守的分子開關，被證明調控多種細胞活動［3-4］。在真菌中，Rho蛋白多被證明參與細胞壁合成及完整性調控、細胞極性維持以及肌動蛋白骨架重組，而這些活動與細胞的生長密切相關。在酵母和絲狀真菌中，Rho1被證明影響細胞壁完整性并參與調節細胞肌動蛋白骨架重組從而影響酵母細胞極性生長，在黑曲霉中，RhoA缺失同樣引起菌絲極性生長缺陷［5-7］。Rho2的功能大多與其他Rho蛋白重疊。Rho3可通過與For3等蛋白結合或減少菌絲端ROS聚集從而參與調控酵母和灰葡萄孢的生長［8-9］。Rho4的N端延伸在酵母極性生長過程中發揮重要功能，并通過調節葡聚糖酶Eng1和Agn1的分泌從而調控酵母的分裂［10］；在粗糙脈孢菌和構巢曲霉中，Rho4則通過參與肌動蛋白環的形成過程從而影響其菌絲分隔和極性生長［11-12］。Cdc42在酵母或絲狀真菌的細胞極性維持和生長過程中發揮中心調控作用［6，13］。Rac1蛋白同樣也被證明在多種絲狀真菌中調控細胞生長［14-16］。在球孢白僵菌中，同樣擁有數個Rho家族蛋白，其中Miro蛋白的功能已被解析［17］，而其余Rho家族蛋白功能仍待研究。

組學是系統生物學的重要組成內容，包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、表型組學、微生物組學等，旨在從整體上揭示生命活動規律，促進對復雜生物體的整體認識［18］。其中，轉錄組學分析方法已在球孢白僵菌生防潛能研究中成熟應用。Shao等［19］通過轉錄譜分析，闡明ΔBbRei菌株嚴重的生長缺陷可能是因為消耗更多能量用于外源性物質降解。此外，通過對胞內基因轉錄水平分析還有助于理解球孢白僵菌中VeA、BbGlc8、BrlA和AbaA等蛋白功能缺失菌株導致的分生孢子減少或毒力減弱的現象［20-22］。

本研究關注球孢白僵菌Rho家族蛋白成員之一Bbrho5，通過同源重組方式構建單基因敲除株ΔBbrho5及對應回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5。通過在不同培養基上，以野生型菌株WT作為對照，測定菌落直徑，闡明BbRho5對球孢白僵菌菌絲生長的影響。進一步從基因轉錄水平探討BbRho5影響的胞內代謝通路，以豐富小GTP酶對昆蟲病原真菌生防潛能的調控作用及機理認識，為進一步拓展開發環保高效的微生物殺蟲劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 以浙江大學生命科學學院實驗室保存的野生型球孢白僵菌ARSEF 2860（即野生菌株WT）、Bbrho5基因缺失菌株ΔBbrho5及回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5為實驗菌種。

1.1.2 培養基 富營養培養基（sabouraud dextrose agar plus yeast extract，SDAY）：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母提取物1%、瓊脂1.5%。1/4 SDAY即SDAY培養基配方稀釋4倍使用。

限制營養培養基（minimal czapek-dox，CZA）：蔗糖3%、NaNO30.3%、K2HPO40.05%、KCl 0.05%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、瓊脂1.5%。

1.2 方法

1.2.1Bbrho5單基因敲除及回補菌株的構建 設計特異性引物（表1），從野生株基因組中擴增各Bbrho5基因的5′和3′端同源臂Bbrho5-up（1 452bp）、Bbrho5-dn（1 329 bp），插 入 質 粒p0380-bar，獲得敲除質粒p0380-Bbrho5-up-bar-Bbrho5-dn。采用農桿菌介導的真菌轉化法將重組敲除質粒轉入野生株中，在選擇性平板上根據bar對草丁膦（200 μg/mL）的抗性篩選疑似敲除突變子，獲得單基因敲除菌株ΔBbrho5。擴增Bbrho5基因包括側翼在內的全長序列Bbrho5-comp（2 725 bp），插入p0380-surgateway中替換gateway片段，獲得回補質粒p0380-sur-Bbrho5。將回補質粒轉入對應的敲除株中，根據sur對氯嘧磺隆（10 μg/mL）的抗性篩選疑似回補突變子，獲得回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5。

表1 Bbrho5單基因缺失及回補菌株構建引物Table 1 Primers for constructing single gene deletion mutant or complementary strains of Bbrho5

1.2.2Bbrho5單基因缺失對球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響 分別刮取野生菌株WT、敲除菌株ΔBbrho5、回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5的分生孢子懸液，分散于吐溫-80液體中，將濃度調整為1×107個/mL，懸液均勻涂布于貼有玻璃紙的SDAY平板上，在25℃和光周期12 h∶12 h條件下培養3 d后，用打孔器鉆取直徑5 mm的菌絲圓片，貼于SDAY、1/4 SDAY或CZA平板上，在25℃和12 h∶12 h條件下培養7 d后，用十字交叉法測量各菌落直徑（cm），作為菌落生長速率的指標。

多菌靈耐受性試驗采用貼濾紙片法，分別取100 μL野生株WT、敲除菌株ΔBbrho5及回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5的分生孢子懸液（1×106個/mL），涂布在1/4 SDAY 平板上，待溶液在平板上風干后，在平板中央貼上直徑5 mm 的無菌濾紙片，在濾紙片上添加10 μL濃度為 0.25 μg/mL的多菌靈溶液。

生物防治能力測試方法：以大蠟螟（Galleria mellonella）幼蟲（～300 mg/只）為試蟲，將40只為一組，分別置于20 mL孢子的懸液（107個/mL）和等量0.02% 吐溫-80液中浸漬5 s，作為體壁侵染的實驗組及對照組。各菌株每個處理包含3組試蟲。接種后的幼蟲在25℃和光照∶黑暗=12 h∶12 h條件下保持8 d，每隔24 h 觀察并記錄試蟲死亡數，以計算各菌株對試蟲的半致死時間LT50（d），作為生物防治能力指標。

1.2.3 轉錄組樣品制備及送測 分別取WT和ΔBbrho5的分生孢子，分散于0.01% 吐溫-80溶液，用血球計數板將孢子濃度調至1×107個/mL。取200 μL菌懸液均勻涂布在鋪有玻璃紙的SDAY 固體培養基上，置于25℃、12 h∶12 h（光照∶黑暗）條件下培養5 d后提取RNA。將RNA送上海美吉公司進行轉錄組測序。RNA質量的測定及定量分別由2100 Bioanalyser（安捷倫）和ND-2000（NanoDrop Technologies）完成。使用高質量的RNA樣品（OD260/280=1.8-2.2，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S∶18S≥1.0，＞2 μg）來構建測序文庫。

根據制造商的指導進行RNA純化、反轉錄、文庫構建和測序。按照來自Illumina（加利福尼亞州圣地亞哥）的TruSeqTM RNA樣品制備試劑盒使用1 μg總RNA制備RNA-seq轉錄組文庫。根據polyA選擇方法，通過oligo（dT）珠子分離mRNA，首先通過片段緩沖液進行片段化；其次，使用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen，CA），用隨機六聚體引物（Illumina）合成雙鏈cDNA；然后根據Illumina 的文庫構建方案對合成的cDNA進行末端修復，磷酸化和A堿基添加。選擇大小為200-300 bp 大小的cDNA目標片段，使用Phusion DNA聚合酶（NEB）進行PCR擴增。通過TBS380定量后，用Illumina Novaseq 6000（2×150 bp讀長）對雙端RNA-seq測序文庫進行測序。

1.2.4 轉錄組數據分析 為了鑒定2個不同樣品之間的DEGs，根據每百萬個外顯子、每千個堿基對的片段數（FPKM）方法，計算每個轉錄本的表達水平。RSEM（http://deweylab.biostat. wisc. edu/ rsem/）用于定量基因豐度［23］。R統計軟件包EdgeR（http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html）用于差異表達分析［24］。此外，還進行了功能富集分析，包括GO分析（https://github.Com/tanghaibao/Goatool） 和KEGG分 析（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php），以確定與整個轉錄組背景，在Bonferroni校正的P值≤0.05時DEGs在基因功能和代謝途徑中顯著富集情況［25］。

2 結果

2.1 Bbrho5單基因敲除及回補菌株的構建

通過農桿菌介導的真菌轉化法和PEG介導的芽孢子轉化法，成功獲得Bbrho5單基因缺失菌株ΔBbrho5及回補菌株ΔBbrho5∷Bbrho5陽性菌株。結果通過菌落PCR進行驗證（圖1）。

圖1 Bbrho5敲除及回補菌落PCR鑒定Fig. 1 PCR verification for Bbrho5 deletion or complementary

2.2 Bbrho5單基因缺失對球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響

在富營養培養基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%。在貧瘠培養基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上實驗結果表明，Bbrho5缺失會引起球孢白僵菌生長速率減緩（圖2）。

圖2 野生菌株、敲除菌株和回補菌株的生長速率測定Fig. 2 Colony diameters of WT，Bbrho5 deletion or complementary stains

此外，Bbrho5缺失對球孢白僵菌多菌靈耐受性及生物防治能力的影響也被檢測。結果表明，不同于Bbrho5對生長的顯著影響，Bbrho5缺失菌株在多菌靈脅迫條件下，菌落生長直徑僅略微下降11%（圖3-A）。以大蠟螟幼蟲為試蟲探究Bbrho5缺失對球孢白僵菌毒力的影響，結果表明，ΔBbrho5對大蠟螟體壁侵染的致死中時LT50相比于野生菌株WT同樣表現出略微的延遲（5.07%）（圖3-B）。

圖3 球孢白僵菌對多菌靈的耐藥性（A）及對大蠟螟的生物防治能力（B）Fig.3 Fungal tolerance to carbendazim（A）and the virulence for G. mellonella larve infection（B）

2.3 ΔBbrho5和WT菌株轉錄組數據分析

2.3.1 質控 WT的3組RNA序列和ΔBbrho5的3組RNA序列的堿基質量大于20（Q20）的占98%以上，堿基質量大于30（Q30）的占94%以上，堿基G和C的數量總和超過總的堿基數量55%，說明本次實驗提取的RNA 序列質量較高，可以用來比較野生型和缺陷型菌株的基因差異表達（表2）。

表2 WT和ΔBbrho5的轉錄組數據質量統計Table 2 Quality statistics of the WT and ΔBbrho5 transcriptome data

2.3.2 序列比對 以相關實驗不存在污染為前提，若參考基因組選擇合適，實驗所產生的測序序列的mapping 率通常會高于65%。Multiple mapped（小片段多為點比對）一般3%左右較好。如表3所示，6組數據的Total mapped均超過95%，Multiple mapped均低于0.6%，說明本次實驗不存在污染及所選的參考基因組較好，可以滿足后續生物信息學分析的需要。

表3 WT及ΔBbrho5序列比對分析結果統計Table 3 Alignment and analysis of WT andΔBbrho5 sequence

2.3.3 表達量差異分析 分別對兩個樣本中基因或轉錄本的表達量對數化處理后，以其為橫坐標作圖，其中每個點代表一個特定的基因或轉錄本［26］。特定的一個點對應的橫坐標值為該基因在對照樣中的表達量，縱坐標值為該基因在處理樣中的表達量。將所有基因映射上去后，越趨近于0的點，表達量越低，越偏離偏對角線程度的點，兩個樣本間表達差異越大。如圖4所示，ΔBbrho5vs WT顯著差異基因共有770個，其中顯著上調基因有395個，顯著下調基因有375個。

圖4 ΔBbrho5 vs WT差異表達基因散點圖Fig. 4 Scatter diagram of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.4 顯著差異基因功能注釋分析 ΔBbrho5vs WT中DEGs功能主要富集于分子功能部分（molecular function，MF），其中氧化還原酶活力（oxidoreductase activity）和單加氧酶活力（monooxygenase activity）功能極為顯著。在生物進程部分（biological process，BP），氧化還原過程（oxidation-reduction process）和跨膜轉運（transmembrane transport）最為顯著（圖5）。

圖5 ΔBbrho5 vs WT差異基因GO富集分析柱形圖Fig. 5 GO analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.5 顯著差異基因功能富集分析 ΔBbrho5vs WT的顯著差異代謝通路最主要富集在氮代謝（nitrogen metabolism），此外，也有多數基因富集到甘氨酸/絲氨酸和蘇氨酸的代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪蛋白氨基酸、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸代謝途徑（圖6）。

圖6 ΔBbrho5 vs WT顯著差異基因功能富集分析Fig. 6 KEGG analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

2.3.6 差異次級代謝產物iPath 通路富集分析 iPath是一款交互式Pathway分析可視化工具，它總結了生物系統中的各種代謝通路，節點表示各種生化分子，線表示生化反應。iPath 2.0（http:// pathways.embl. de）現有3個大類型的通路圖譜。Metabolic pathways：生物系統中整體代謝，包含146條KEGG通路；Regulatory pathways：包含22條KEGG 調控途徑；Biosynthesis of secondary metabolites：包括參與次生代謝產物生物合成的58個KEGG途徑。利用iPath 2.0可對基因集參與的代謝途徑進行可視化分析，以查看整個生物系統的代謝通路信息，圖7為ΔBbrho5vs WT的iPath 代謝通路圖。

圖7 ΔBbrho5 vs WT的iPath代謝通路分析Fig. 7 iPath analysis of DEGs between ΔBbrho5 and WT

3 討論

生長是球孢白僵菌重要的生防潛能指標之一，影響球孢白僵菌生活史進程，在球孢白僵菌侵染過程中，減緩菌絲生長速率可通過延緩產孢、緩慢侵染從而降低微生物殺蟲劑的生防效力。因此，對調控球孢白僵菌生長速率的基因功能研究具有重要的理論及應用意義。近年來，已有眾多影響球孢白僵菌生長的基因或蛋白相繼被發現，包括MAPK激酶Pbs2、Mkk1和Ste7；熱休克轉錄因子Hsf1、Sfl1以及 Skn7；細胞質60S前亞基輸出因子BbRei1及WSC1蛋白等，這些蛋白的缺失均引起球孢白僵菌菌落生長速率遲緩［27-30］。

小GTP酶作為調控細胞信號傳導途徑的分子開關，行使各種生物學功能，包括細胞極性生長、細胞形態發生、細胞分裂等［31-32］。在我們之前的工作中，已成功構建球孢白僵菌小GTP酶Ras3和Miro單基因敲除菌株，并檢測了它們對球孢白僵菌菌絲生長速率的影響。在SDAY和1/4 SDAY培養基上，ras3缺失菌株Δras3顯示出增強的菌絲生長速率，表明Ras3負調控球孢白僵菌菌絲生長速率［33］。與此不同，Miro調控球孢白僵菌細胞內線粒體總量、分布及ATP含量，而Miro功能缺失引起球孢白僵菌菌絲生長速率減緩［17］。在本實驗中，成功構建球孢白僵菌Rho5蛋白單基因缺失菌株ΔBbrho5及其對應回補菌株ΔBbrho5∷ΔBbrho5。在SDAY、1/4 SDAY及貧瘠培養基CZA培養基上，ΔBbrho5均表現出受抑制的菌絲生長速率：在富營養培養基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%；在貧瘠培養基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上結果表明，小GTP酶對球孢白僵菌生長速率的調節可能是多向的，因基因不同而異，BbRho5正向調控球孢白僵菌菌絲生長速率，這和Miro蛋白功能缺陷引起的表型類似。

提取ΔBbrho5及WT菌株RNA，借助Illumina Hiseq 測序平臺完成轉錄組測序并對數據進行分析。結果表明，ΔBbrho5vs WT共獲得顯著差異表達基因（DEGs）770個，其中顯著上調基因有395個，顯著下調基因有375個。對ΔBbrho5vs WT基因集中的DEGs進行GO功能富集分析，結果表明DEGs功能主要富集于分子功能部分（molecular function，MF），其中氧化還原酶活力（oxidoreductase activity）和單加氧酶活力（monooxygenase activity）功能極為顯著。在生物進程部分（biological process，BP），氧化還原過程（oxidation-reduction process）和跨膜轉運（transmembrane transport）最為顯著。通過KEGG富集通路分析，結果表明，ΔBbrho5vs WT的DEGs顯著差異代謝通路最主要富集在氮代謝（nitrogen metabolism），此外，也有多數基因富集到甘氨酸/絲氨酸和蘇氨酸的代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪蛋白氨基酸、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸代謝途徑。在微生物細胞中，氮源需要轉變為谷氨酸和谷氨酰胺才能進一步被利用，因此，谷氨酸和谷氨酰胺在氮代謝中發揮著重要作用。谷氨酸合酶被證明可正向調控靈芝菌絲生長［34］，谷氨酰胺合成酶是一個重要的氮源調節因子，影響微生物對氮源及能源的利用。在刺糖多孢菌中，谷氨酰胺合成酶基因的敲除同樣引發顯著的生長抑制［35］。在ΔBbrho5vs WT的DEGs中，富集到氮代謝通路中的功能基因有7個，其中5個上調，2個下調，說明敲除菌株可能采用增強氮源利用以應對Bbrho5缺陷引起的生長遲緩。在上調基因中，包含了重要的谷氨酸合酶（glutamate synthase）基因和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）基因，這在轉錄水平上揭示了ΔBbrho5細胞內谷氨酸合成水平增強，暗示ΔBbrho5可能通過調節上升的氮代謝，進而促進谷氨酸合成，以應對生長速率減弱的生防潛能缺陷。

4 結論

本研究成功構建球孢白僵菌Bbrho5單基因缺失菌株ΔBbrho5，Bbrho5單缺失能夠引起球孢白僵菌的顯著生長缺陷，并對球孢白僵菌抗多菌靈能力及其生物防治能力效果極微。轉錄組數據分析表明ΔBbrho5可能通過氮代謝及多種氨基酸代謝作為響應通路調節菌體的生長速率。