鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜結構及菌群的影響

謝果珍 唐圓 寧曉妹 邱集慧 譚周進

（湖南中醫藥大學，長沙 410208）

高脂高糖飲食是當代社會常見的飲食模式，也是肥胖、糖尿病、高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病的誘因。與此同時，人們越來越認識到疾病與腸道有密切的關系。健康的腸道有助于機體抵御疾病、維持健康狀態，而影響腸道健康的兩個關鍵因素是腸黏膜屏障及腸道菌群［1］。腸黏膜屏障是機體極其重要的防線，如腸黏膜受損將導致細胞間的通透性增加，共生細菌、病原菌、病毒及毒素等物質穿過腸黏膜進入機體的其他組織或器官，引發疾病。腸道菌群在機體代謝及免疫中的重要性已被廣泛證實，腸道菌群失調是疾病發生發展的主要原因。研究表明長期高脂飲食提高了腸道炎癥細胞因子信號，降低腸黏膜屏障的完整性，降低杯狀細胞分化，減少黏蛋白MUC 2及緊密連接蛋白Claudin-1的表達，增加血清內毒素水平，從而誘發慢性腸道炎癥［2］。另外，高脂飲食改變了腸道微生物的組成及多樣性，造成腸道微生態失衡［3-4］。

多糖是一類難被人體直接消化吸收，但對腸道微生態有積極調節作用的成分。研究表明，多糖可減少代謝內毒素，降低炎癥因子的表達，增加緊密連接蛋白的表達，從而緩解腸黏膜損傷，改善腸道完整性；可通過促進有益菌的增殖和減少有害菌的數量以形成更健康的菌群結構；還可提高碳水化合物活性酶的活性，提高代謝效率，生成短鏈脂肪酸以進一步影響機體免疫［5-8］。因此，多糖已成為功能性食品開發的重要成分。鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，具有“久服厚腸胃”的作用，多糖是其主要成分［9］。已有研究顯示鐵皮石斛多糖（Dendrobium officinalepolysaccharides，DOP）對大鼠口服無水乙醇誘導的胃黏膜損傷有保護作用［10］；可減輕結腸病理損傷，改善右旋糖酐硫酸酯鈉誘導的急性潰瘍性結腸炎［11］，但對高脂飲食引起的腸黏膜損傷及腸黏膜菌群的影響研究較少。因此本研究考察鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜結構及菌群的影響，以期為鐵皮石斛多糖的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 都市主婦全能小鋼磨（永康市鉑歐五金制品有限公司），202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），HA-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠），Nano-drop 2000/2000C紫外分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司），YD-A生物組織攤片機（上海珂淮儀器有限公司），RM2235石蠟切片機（德國徠卡），MOTIC BA410研究型顯微鏡（廈門麥克奧迪），MOTIC 6.0數碼醫學圖像分析系統（廈門麥克奧迪），電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 新鮮鐵皮石斛購于昆明市螺螄灣中藥材市場，經湖南中醫藥大學王智講師鑒定為正品。無水葡萄糖、無水乙醇、硫酸、苯酚均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。4%多聚甲醛（Biosharp），HE染液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.1.3 實驗動物與飼料 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性昆明（KM）小鼠15只，體質量為（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］。小鼠購回后于室溫 20-22℃，相對濕度50%-70%環境下分籠飼養，自由取食及飲水。小鼠基礎飼料及高脂飼料（87.5%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.5%豬膽鹽）由北京科澳協力飼料有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖的制備 新鮮鐵皮石斛洗凈后晾干，在105℃鼓風干燥箱中殺青30 min后60℃烘干。將干燥的鐵皮石斛打粉，過60目篩，稱重后加30倍量蒸餾水，90℃水浴提取1 h，紗布過濾，重復3 次，合并濾液，蒸發濃縮，濃縮液冷卻后加3倍體積75%乙醇，攪拌均勻后于4℃沉淀過夜，沉淀用75%乙醇洗滌3次后烘干至恒重，研磨成粉末后密封放于干燥器中備用。鐵皮石斛多糖的提取率為31.75%，用苯酚-硫酸法測得鐵皮石斛多糖中總糖的質量分數為62.23%。

1.2.2 動物分組及給藥 小鼠適應性飼養1周后隨機分成正常組（N）、高脂飲食組（H）和鐵皮石斛多糖組（HP），每組5只。正常組給予基礎飼料，高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組給予高脂飼料，3組小鼠自由飲水。同時，正常組及高脂飲食組灌胃無菌水，鐵皮石斛多糖組灌胃鐵皮石斛多糖溶液。參考《中華人民共和國藥典》（2020版）［12］，按成人9 g/d的用量及提取率計算鐵皮石斛多糖的小鼠臨床等效用量為350 mg/kg/d，灌胃量為0.4 mL/只/次，每天1 次，連續8 周。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，倫理批準號為LL2020071001。

1.2.3 取材 灌胃鐵皮石斛多糖8周后取材，取材前12 h禁食不禁水，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取小腸段，擠出腸道內容物后剖開小腸，用生理鹽水清洗2次后用滅菌的蓋玻片刮取黏膜，裝于無菌EP管。所有樣本凍于-20℃冰箱待測。

1.2.4 腸組織切片制備及觀察 取各組小鼠相同部位的結腸0.5 g，置于4% 多聚甲醛中固定，制備石蠟包埋切片，HE染色后用顯微鏡觀察結腸黏膜形態并拍照。

1.2.5 16S rRNA基因測序 所有腸道黏膜樣本提取基因組DNA后進行PCR擴增與產物純化，質檢合格后對細菌16S rRNA基因（V3+V4）測序（Illumina HiSeq 2500），引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.6 生物信息學分析 對原始數據進行質量過濾，用 USEARCH（version 10.0）對所得到的高質量序列在相似性 97%的水平上進行聚類得到OTU，利用SILVA數據庫（Release132，http://www.arb-silva.de）進行物種注釋。用QIIME 2（https://qiime2.org/）分析Alpha及Beta多樣性。

1.2.7 統計學分析 用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學分析，結果用平均值 ± 標準差（x-±s）表示。用獨立樣本t檢驗進行2組間的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜結構的影響

圖1可見，正常組小鼠腸黏膜表面光滑、完整，細胞境界清楚，排列緊密，形態結構正常；高脂飲食組小鼠腸黏膜萎縮、脫落，伴炎性滲出；鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜表面光滑、完整，細胞境界清楚，排列緊密，形態結構正常，說明鐵皮石斛多糖對腸黏膜結構具有保護作用。

圖1 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜結構的影響Fig. 1 Effects of DOP on the intestinal mucosal structure of mice fed a high fat diet

2.2 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜菌群的影響

2.2.1 OTU及Alpha多樣性分析 對原始序列進行質控、拼接后得到的有效序列在97%的相似度水平下進行聚類，所有樣本共得到719條OTU。從Venn圖（圖2）可看出正常組、高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的OTU數分別為541、567、531條，其中共有OTU為349條，特有OTU分別為65、50、33條。

圖2 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜菌群OTU的影響Fig. 2 Effect of DOP on the OTU of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet

對樣品Alpha多樣性指數進行評估，發現高脂飲食及鐵皮石斛多糖均提高了小鼠腸黏膜菌群的多樣性。與正常小鼠相比，高脂飲食組小鼠腸黏膜菌群多樣性無顯著性差異，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的Simpson及Shannon指數有顯著性差異（Simpson，P＜ 0.05；Shannon，P＜ 0.05）（圖3）。

圖3 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜菌群Alpha多樣性的影響（x-±s，N=5）Fig. 3 Effect of DOP on the Alpha diversity of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet（x-±s，N = 5）

2.2.2 Beta多樣性分析 采用binary jaccard算法進行PCoA（principal coordinates analysis）分析，從圖4可知，正常組小鼠腸黏膜菌群較相似，而高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組組內小鼠的腸黏膜菌群差異較大。從總體而言，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群與正常組小鼠差異較大，可明顯區分，而高脂飲食組小鼠有與正常組小鼠腸黏膜菌群相似的樣本，也有接近鐵皮石斛多糖組的樣本，可能與不同小鼠個體對高脂飲食及鐵皮石斛多糖的響應差異有關。

圖4 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜菌群Beta多樣性的影響（N=5）Fig. 4 Effect of DOP on the Beta diversity of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet（N = 5）

2.2.3 物種分類信息 參照SILVA數據庫（Release132，http://www.arb-silva.de）進行分類學注釋，在15個樣本中共注釋得到19個菌門，348個菌屬。在門水平上，3組小鼠腸黏膜中豐度最高的3個菌門分別為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria，在正常組小鼠中Cyanobacteria及Epsilonbacteraeota的相對豐度較高，而高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Bacteroidetes的相對豐度增加，取代Cyanobacteria成為相對豐度第4的菌門。鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Firmicutes的相對豐度與正常組相比顯著下降（P＜ 0.05），Epsilonbacteraeota的相對豐度與高脂飲食組相比顯著提高（P＜ 0.05）（圖5-A）。

在屬水平上，Lactobacillus是不同處理中小鼠腸道的優勢菌屬。從圖5-B可以看出，高脂飲食及鐵皮石斛多糖處理后小鼠腸道菌群的結構發生了較大的改變，以相對豐度前5的菌屬為例，正常組小鼠腸黏膜的優勢菌群依次為Lactobacillus、Candidatus_Arthromitus、Staphylococcus、uncultured_bacterium_o_Chloroplast、Brevibacterium；高脂飲食組小鼠腸黏膜的優勢菌群依次為Lactobacillus、Staphylococcus、Candidatus_Arthromitus、Corynebacterium_1、Ochrobactrum；鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜的優勢菌群依次為Lactobacillus、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Candidatus_Arthromitus、Staphylococcus、Enterorhabdus。

圖5 鐵皮石斛多糖對高脂飲食小鼠腸黏膜菌群結構的影響Fig. 5 Effect of DOP on the structure of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet

與正常組相比，高脂飲食顯著減少了Escherichia-Shigella（P＜0.05）、RB41（P＜0.05）、uncultured_bacterium_f_Intrasporangiaceae（P＜ 0.05）的相對豐度。與高脂飲食組相比，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度顯著 增 加（P＜ 0.05）。經 過LEfSe（line discriminant analysis（LDA）effect size）分析，發現不同組間具有統計學差異的生物標志物（biomarker）。具體地，Corynebacterium_1、Staphylococcus是高脂飲食組小鼠腸黏膜菌群的重要菌屬，而鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的重要菌屬為Enterorhabdus（圖6）。

圖6 高脂飲食及鐵皮石斛多糖處理后產生的特異性菌Fig. 6 Biomarker of mucosa-associated microbiota after DOP and high-fat diet treating

3 討論

腸道黏膜是機體抵御病原微生物入侵的主要屏障，腸黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、生物屏障及免疫屏障共同組成。其中，機械屏障由上皮細胞、細胞間緊密連接、菌膜及黏液層組成，如上皮細胞受損脫落，容易導致腸道通透性增加，細菌異位，進而加大感染的風險［13-14］。Schroeder等［15］的研究顯示給予小鼠高脂肪、低纖維的飲食會增加腸道黏膜內黏液層的滲透率。Ding等［16］的研究報道了與肥胖相關的腸道炎癥主要發生在小腸，而Gulhane等［2］的研究顯示長期高脂飲食導致遠端結腸炎癥增加。因此本研究考察了高脂飲食及鐵皮石斛多糖對小鼠結腸黏膜結構的影響，結果顯示高脂飲食破壞了小鼠結腸黏膜結構，表現出腸黏膜萎縮、上皮細胞脫落并伴有炎性滲出，而鐵皮石斛多糖減輕了高脂飲食對腸黏膜結構的損傷，證實了功能性多糖對腸黏膜屏障有保護及修復作用。

腸道菌群分為腸腔菌群及腸黏膜菌群，腸腔菌群存在于腸腔液中，不與上皮細胞直接接觸，且受飲食及藥物的影響較大，腸黏膜菌群相對穩定［17-18］。腸黏膜菌群是腸道生物屏障的重要部分，可維持腸道屏障的完整性，研究表明腸黏膜菌群在誘導宿主免疫和炎癥過程中起到關鍵作用［19-20］，因此針對腸黏膜菌群的相關研究日益增多。本研究考察了高脂飲食及鐵皮石斛多糖對腸黏膜菌群的影響，發現高脂飲食及鐵皮石斛多糖均提高了腸黏膜菌群的多樣性，且鐵皮石斛多糖的影響更深遠。進一步分析不同處理小鼠腸黏膜菌群的結構及組成可知高脂飲食及鐵皮石斛多糖極大改變了腸黏膜菌群，具體表現為高脂飲食使有害菌屬大量增殖，而鐵皮石斛多糖則增加了碳水化合物代謝相關菌屬及短鏈脂肪酸產生菌屬的數量。本研究發現Corynebacterium_1、Staphylococcus是高脂飲食組小鼠腸黏膜的重要菌屬。Corynebacterium及Staphylococcus中有大量與感染、炎癥相關的菌種，如Corynebacteriumdiphtheriae、Corynebacteriumsimulans、Corynebacteriumulcerans、Corynebacterium glucuronolyticum、Staphylococcusaureus、Staphylococcusepidermidis等。Corynebacterium的病原菌株可導致乳腺感染［21］、泌尿系統感染［22］、上呼吸道感染［23］、角膜炎［24］、脊柱炎［25］，而Staphylococcus的病原菌株可引起敗血癥、感染性心內膜炎、肺炎、眼部感染和中樞神經系統感染［26］。Corynebacterium_1及Staphylococcus在小鼠攝入高脂飲食后其豐度大大提高，或可說明高脂飲食破壞了腸黏膜完整性后導致了有害菌的入侵，繼而引發炎癥反應，而鐵皮石斛多糖可降低兩者的豐度，且對Corynebacterium_1的抑制作用強于Staphylococcus。

多糖具有益生元特性，其有益作用主要體現為對腸道菌群的組成及其代謝產物的影響［1］。Candidatus_Arthromitus是定植于脊椎動物腸壁，與吸收性腸上皮細胞表面緊密結合的一類共生菌，屬于節段絲狀細菌（segmented filamentous bacteria，SFB）的一種。Candidatus_Arthromitus可通過促進腸道Th17細胞的分化和成熟以及免疫球蛋白A（IgA）的產生促進小鼠和大鼠的適應性和先天免疫，提高宿主抵御病原體的能力，有助于建立一個健康的腸道環境［27］。在本研究中，Candidatus_Arthromitus是正常小鼠腸道黏膜的優勢菌屬，高脂飲食使其豐度降低，而鐵皮石斛多糖使其豐度回調，趨近于正常水平，說明鐵皮石斛多糖有助于維持腸道黏膜中有益菌Candidatus_Arthromitus的數量，以發揮其免疫作用，保護機體。

短鏈脂肪酸在黏膜T調節細胞調控中起決定作用，有助于腸道修復。在本研究中，擬桿菌門Bacteroidetes的相對豐度在鐵皮石斛多糖組小鼠腸道黏膜菌群中高于正常組及高脂飲食組，主要與Muribaculaceae及Bacteroides豐度的增加有關。Muribaculaceae是擬桿菌門的優勢菌科，Bacteroides是擬桿菌門的重要菌屬，具有大量與碳水化合物代謝相關的基因，可編碼產生糖基轉移酶、糖苷水解酶和多糖裂解酶等酶以代謝碳水化合物，進而為宿主提供重要的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等［28-29］。現有研究發現許多天然多糖可顯著上調Muribaculaceae及Bacteroides的豐度［30-32］，一方面反映了機體對外源化合物的適應性代謝，另一方面發酵碳水化合物后得到的代謝產物亦可參與免疫影響宿主健康。有學者認為Muribaculaceae的豐度與丙酸有很強的相關性，因此可作為SCFAs濃度的預測因子［28］。此外，與高脂飲食組相比，丁酸產生菌Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度在鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中有顯著上升。丁酸可減少細菌易位，還可通過增加Caco-2單層細胞的跨上皮電阻（TEER）顯著提高改善腸道完整性［33］。可見，有益菌及短鏈脂肪酸產生菌的增殖，進一步增加體內短鏈脂肪酸的含量，提高免疫功能，可能是鐵皮石斛多糖改善腸黏膜屏障的機制之一。

4 結論

高脂飲食破壞了腸黏膜結構，促進了炎癥及感染相關菌的增殖，加大了腸道感染的風險，而鐵皮石斛多糖可抑制有害菌的增殖，促進有益菌及短鏈脂肪酸產生菌的增殖，調節腸道菌群結構，并改善腸道屏障的完整性，對機體腸道具有保護作用。