納豆中抗氧化肽的分離純化與活性研究

張豐文 周麗亞 董超 史延茂

（1. 河北工業大學化工學院，天津 300401；2. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081）

傳統的抗氧化物有維生素C、二丁基羥基甲苯（BHT）等，可以延緩衰老，在某些疾病的治療方面有著重要的輔助作用。隨著生物健康產業的深入研究發現，生物活性肽也具有抗氧化和清除自由基的作用，包括肌肽、玉米肽、大豆肽、菜籽肽和海洋生物活性肽等，如王禹程等［1］從菜籽粕中提取了菜籽肽；姜源等［2］利用酶解法從玉米蛋白粉中提取了玉米五肽。這些生物活性肽原料充足，加工工藝簡單，整體生產成本可控，是目前功能性食品領域的一個研究和應用熱點。大豆抗氧化活性肽（soybean antioxidative peptide）是大豆蛋白水解產物中具有抗氧化功效的多肽，溶解度高，黏度低，穩定性好［3］。人體攝入后，可以在一定程度上消除機體內多種生理功能的障礙，如大豆肽可阻礙脂肪的吸收和促進脂肪分解代謝、降低總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量，提高高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）含量，大豆肽通過阻止腸道內膽固醇的重吸收，并促使其排出體外而降低血清膽固醇的水平［4］。大豆肽還可延緩機體的衰老，如徐天等［5］研究發現，自由取食含有大豆低聚肽和大豆低聚糖的桑葉的家蠶，其幼蟲期和成蟲期的平均壽命和最高壽命都有顯著的延長。可見，大豆肽在抗衰老方面有著重要的運用。目前國內外對大豆肽的制備方法主要集中在酶解法，如曾婷和馬福建等［6］用5種不同的酶水解豆粕發現，對大豆球蛋白水解效果較好的酶為胰蛋白酶。de Castro等［7］采用多種微生物蛋白酶水解大豆分離蛋白，結果表明大豆分離蛋白肽抗氧化活性比水解前提高了7倍。de Oliveira等［8］采用蛋白酶組合方法水解大豆分離蛋白，能有效提高其抗氧化活性、乳化活性及起泡能力。利用生物工程技術對大豆蛋白進行發酵分解也是制備抗氧化肽的方法之一，如Amadou等［9］利用植物乳酸桿菌Lp6發酵脫脂大豆，獲得5種抗氧化活性較強的多肽。Chi等［10］測定了芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌發酵脫脂大豆后的抗氧化活性，其中芽孢桿菌發酵產物的抗氧化活性最強，酵母菌和乳酸菌發酵前后都沒有明顯改變。大豆發酵后的多肽抗氧化活性與其分子量、氨基酸成分以及空間結構相關，但是大多數研究只是針對一個小肽進行驗證研究，對氨基酸成分和空間結構研究較少。

本研究以由納豆芽孢桿菌發酵大豆后的納豆為原料發現，納豆中多肽抗氧化活性有所提高，推測與多肽的生成相關，并利用柱層析分離純化納豆多肽混合物并用LC-MS/MS技術，對納豆中的抗氧化肽進行了氨基酸序列鑒定，來探究抗氧化肽活性增強的原因，旨為進一步研究納豆抗氧化肽的性質和食用功能性開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 納豆粉由河北省科學院生物研究 所 提 供；Na2HPO4·10H2O、KH2PO4、Na2CO3和DPPH等所有試劑均為國藥集團的AR純，甲醇、乙腈等試劑均為進口色譜純。T-AOC試劑盒（FRAP法）來自南京建成生物工程研究所；葡聚糖凝膠G50來自武漢匯研生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 毛細管高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）（美國）；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀（Thermo Fisher Scientific）（美國）；AKTA purifier10（美國GE公司）；液相色譜儀LC-20A（日本島津有限公司）；恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 納豆抗氧化活性肽的制備 取納豆粉10 g，溶于200 mL的PBS緩沖液中，在4℃下10 000 r/min高速離心30 min后，取上清液用50 kD超濾膜超濾，取分子量小于50 kD的部分分小管凍存。

1.2.2 納豆Tricine-SDS-PAGE電泳 參考 Schagger［11］報道的方法并略做修改。電泳條件：16.5%的分離膠、10%的間隙膠和4%的濃縮膠，樣品與4×樣緩沖液混合，每個凝膠孔里加入20 μL樣品，先在80V電壓下跑30 min，然后調到120V電壓下跑2h。電泳結束后，采用考馬斯亮藍染色處理膠片，用去離子水脫色。

1.2.3 納豆抗氧化肽的分離純化 凝膠過濾色譜分離：將粗提液經過0.22 μm微孔濾膜過濾后，將Sephadex G-50凝膠柱連接到AKTA儀器進行分離純化。色譜分離條件為：進樣量為1 mL，以磷酸鹽緩沖液作為洗脫液，洗脫液流速1.0 mL/min，在波長280 nm處收集各分離峰組分，多次收集，冷凍干燥后測定其抗氧化活性。

RP-HPLC分離：取上一步分子篩層析分離所得抗氧化活性最高的組分，采用反相高效液相色譜C18半制備柱以進一步分離純化。色譜分離條件為：色譜柱：ShamiduC18（5 μm×150 mm），進樣量5 mL，流動相A為0.1%TFA水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈，流速為5 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為280 nm，洗脫條件如表1。多次重復進樣收集各分離峰，對各組分進行濃縮。調整多肽濃度至0.1 mg/mL，比較DPPH自由基清除能力。

表1 半制備RP-HPLC的洗脫條件Table 1 Elution conditions of semi preparative RP-HPLC

1.2.4 LC-MS/MS法鑒定抗氧化肽氨基酸序列 通過Semi-HPLC分離后的抗氧化肽樣品應用LC-MS/MS法進行分析。分析柱：150 μm×150 mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，1.9 μm，100?；流動相A：0.1%甲酸，2% CAN；流動相B：0.1%甲酸，80% CAN；洗脫條件如表2，流速600 NL/min。

表2 洗脫時間表Table 2 Elution schedule

質譜條件：一級質譜參數：分辨率 70 000；自動增益控制目標（AGCtarget）3×106；最大駐留時間：40 ms；掃描范圍 100-15 00 m/z；二級質譜參數：分辨率 17 500；自動增益控制目標 1×105；最大駐留時間：60 ms；TopN 20；NCE/steppedNCE 27。

1.2.5 抗氧化活性的測定 FRAP測定還原力［12］：操作方法根據南京建成生物研究所總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒說明書，每個樣品作3個平行試驗。以硫酸亞鐵為標準物，得到線性方程y=0.301 3x-0.018 5，R2=0.999 9。樣品中的總抗氧化活性通過該方程計算得到。

DPPH清除能力實驗：用無水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液，取0.5 mL樣品和3.5 mL DPPH 溶液混合，避光靜置30 min，檢測波長517 nm，分光光度計測定OD值，DPPH清除能力按照下述公式進行計算，并以0.5 mL的無水乙醇做空白對照［13］。

式中：A1為樣品加入DPPH 溶液后的OD值；A2為樣品溶液的OD值；A3為乙醇加入DPPH溶液（空白對照）的OD值。

1.2.6 樣品中蛋白濃度的測定 利用Braford法對樣品中的總蛋白含量進行測定。先配制一系列濃度梯度的BSA溶液，在96孔板每個孔中加入20 μL樣品，然后在每個孔里加入200 μL的考馬斯染液。在室溫下充分混勻，放置5 min，在595 nm波長下檢測吸光度。以牛血清白蛋白為標準品進行測試，并得到線性方程y=0.002 1x-0.007 2，R2=0.994 0。樣品中的總蛋白含量通過該方程計算得到。

1.2.7 G1中肽段的合成及活性驗證 杭州專肽生物公司合成，活性測定采用DPPH清除率的方法。

1.2.8 統計學分析 數據均由平行測試得到，以平均值±標準差表示。顯著性差異通過GraphPad Prism 7的ANOVA-Tukey 計算得到，P＜0.05 表示結果具有顯著性差異。

2 結果

2.1 蛋白濃度的測定及Tricine-SDS-PAGE電泳圖

通過實驗，得到線性方程y=0.002 1x-0.007 2，R2=0.994 0。將測得的粗提液吸光度代入標準曲線換算得納豆粗提液蛋白濃度為0.37 mg/mL。大豆發酵前后的蛋白分子量變化如圖1所示，發酵前蛋白的分子量大多在20 kD-66 kD之間，而發酵后大多集中在20 kD以下。由此可見，發酵后形成的多為小于20 kD的肽段。

圖1 Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 Tricine SDS PAGE electrophoretogram

2.2 凝膠過濾色譜分離及各組分活性分析

選擇制備好的納豆上清液予以分離純化，圖2為納豆提取上清液的凝膠過濾分離色譜圖。經凝膠過濾分離后，主要富集得到3個組分峰，分別標記為F1、F2和F3，其中F1組分出峰時間最早，表明其分子量最大，F3組分出峰時間最晚，表明其分子質量最小。

圖2 SephadexG-50凝膠層析圖譜Fig. 2 SephadexG-50 chromatogram

將凝膠色譜分離所得各組分峰收集后冷凍干燥，分別溶于1 mL超純水中，結果如表3所示。比較各組分的FRAP值，F3組分的還原力顯著高于（P＜ 0.05）其它各組分，其值高達（8.4±0.6）mmol/g。綜合上述抗氧化活性結果可知，F3組分的抗氧化活性最強，可予以進一步分離純化，富集出高活性抗氧化肽。

表3 SephadexG-50組分抗氧化活性Table 3 Antioxidant activities of fractions from SephadexG-50 column

2.3 反相高效液相色譜（RP-HPLC）進一步分離及各組分的抗氧化活性

如圖3所示，0-15 min內和60 min后出現的是溶劑峰，而樣品峰主要集中在20-60 min內，樣品峰中存在較多雜峰，說明經G50純化后樣品純度較低，根據各峰的分離效果和響應值大小，收集4個主要的洗脫峰G1、G2、G3和G4，各洗脫峰的保留時間分別為20.87 min、25.3 min、37.0 min和42.4 min，洗脫峰與總峰面積比分別為6.44%、2.45%、17.59%和5.30%。從中可以看出G1、G3峰面積占比較大，從而推斷G1、G3組分含量高，且響應值較高，可能為主要的效應物質，因此選擇收集G1和G3組分。

圖 3 F3 組分的 RP-HPLC圖Fig. 3 RP-HPLC analysis of fraction F3

多次收集G1和G3，冷凍干燥，用超純水溶解，濃縮成1 mg/mL的質量濃度溶液，比較G1和G3的DPPH清除率。從圖4中可以看出G1組分的清除率顯著性高于（P＜ 0.05）G3組分，其清除率高達32.67%。綜上述可知，組分G1的抗氧化活性最強，可用于后續的質譜鑒定和結構分析。

圖 4 G1和G3的DPPH清除率Fig. 4 DPPH scavenging rates of G1 and G3

2.4 LC-MS/MS法鑒定抗氧化肽氨基酸序列

使用LC-MS/MS對G1進行肽序列鑒定，肽段斷裂之后形成的二級質譜圖如圖5所示，橫坐標為質荷比，縱坐標為強度。圖中的各峰代表母離子斷裂成b、y離子形成的碎片離子峰，斷裂模式為HCD。圖5-A中y2代表PA離子，y3代表IPA離子，Y3-Y2的質量差與異亮氨酸Ile相符，同理b2代表斷裂后的RA離子，b3代表斷裂后的RAE兩離子峰的質量差與谷氨酸相符，依次類推就可得到氨基酸的序列為RAELSEDVFVIPA。每個質譜圖右上角的數字代表了該肽段的斷裂方式，以及所能形成的b、y離子。

圖5 G1的各肽段二級質譜圖Fig. 5 Secondary mass spectra of G1 peptides

FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH有Leu-Leu重復序列，與此研究結果一致，表明疏水性氨基酸對抗氧化活性的影響較大。如表4所示，G1的各肽段信息如下。從中可以看出其分子量在0.5-1.5 kD之間，與之前的凝膠過濾比分子量小了很多。

表4 G1的各肽段信息Table 4 Peptide information of G1

2.5 合成肽的驗證及抗氧化活性分析

稱取適量的多肽進行溶解，得到2.5 mg/mL的溶液。采用DPPH·清除率的方法對其進行測定，結果如圖6所示，其中肽段7的活性最強；其次是肽段10，分別為42.66%和31.02%。其中肽段7比起肽段10不同的是含有色氨酸，從實驗結果看，應該是色氨酸起了增強活性的作用。

圖 6 各肽段抗氧化活性Fig. 6 Antioxidant activity of each peptide segment

3 討論

對納豆中的多肽成分進行一系列分離純化取得G1和G3組分，質量濃度為1 mg/mL時，DPPH自由基清除率分別為32.67%、10.67%，其中G1組分抗氧化活性最高。用ESI-MS/MS鑒定出了組分G1中含量最高的10種多肽，其中肽段7在IC50（2.5 mg/mL）時的DPPH清除率為46.66%，與合成的菜籽抗氧化肽 WDHHAPQLR的DPPH自由基清除率IC50（0.91 mg/mL）相比，活性較低。

一些研究表明氨基酸組成對多肽抗氧化活性起到關鍵性作用，氨基酸結構是抗氧化肽的活性位點。例如，Agrawal等［14］從米粟蛋白酶解產物中分離純化出一條新型的抗氧化活性多肽序列SDRDLLGPNNQYLPK，分析結果表明，疏水氨基酸包括甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）以及亮氨酸（Leu）等的含量較高，同時序列里重復出現 Leu-Leu，推測Gly、Pro和Leu可能是活性位點。Ghassem等［15］認為含苯環的氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）能夠為自由基提供質子，減緩自由基鏈式反應，此類氨基酸能夠通過共振作用維持自身穩定。張暉等［16］認為堿性氨基中的賴氨酸是電子受體，能夠接受不飽和脂肪酸氧化過程中產生的自由基的電子，還有組氨酸中咪唑基的降解，使得其也具有自由基清除能力。該研究結果顯示含有疏水性氨基酸的多肽具有較高的自由基清除能力，主要包括亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）。例如，經鑒定出的肽段FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH有Leu-Leu重復序列，與Agrawal的研究結果一致。

目前所研究的抗氧化肽大多是少于20個氨基酸殘基的分子，且分子質量小于6 kD［17］。Li等［18］的研究表明，具有強抗氧化活性的肽的分子質量分布在0.5-1.5 kD之間。Moure等［19］研究的豆渣蛋白水解產物的4個不同分子質量組分（5-10 kD、10-30 kD、30-50 kD和＞50 kD）中，低分子質量組分具有較高的抗氧化活性，分子質量＞10 kD的組分抗氧化活性最低。Chen等［20］水解大豆7S蛋白，獲得6種多肽，其分子量＜1 kD的組分抗氧化活性較強。本實驗的抗氧化肽分子量在0.4-1.5 kD之間，由3-14個氨基酸組成，其中肽段RAELSEDDVFVIPA的相對豐度最高。

另外，本實驗用超微液相（UHPLC/Nano LC）與二級質譜（Orbitrap-Orbitrap等）聯用技術，對多肽氨基酸序列實現了高靈敏度、高分辨率的測定。高分辨率質譜的是多肽鑒定的重要技術手段，如Liu等［21］采用電噴霧-四級桿飛行時間質譜（LC-ESIQ-TOF）技術從榛子蛋白水解產物中鑒定出6種抗氧化多肽序列，分別為ADGF、AGGF、ETTL、SGAF、AWDPE和DWDPK，得出含有色氨酸的肽段活性最強。本研究從納豆水解上清液中鑒定出了10種抗氧化肽，其氨基酸序列為RAELSEDDVFVIPA、LSEDDVFVIPA、DVFRAIPSEVL、FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH、LAVLI、SFEWVLEH、GIFGM、QVFL和FPF；其分子量分布范圍為0.4-1.6 kD。經過Uniport查庫分析，這些肽段大多來自7S球蛋白（β-伴大豆球蛋白）和11S球蛋白（大豆球蛋白），也是納豆芽孢桿菌的發酵過程中蛋白酶主要分解原料。

4 結論

本研究探索了納豆中抗氧化肽的分離純化方法，利用分子篩層析和高效液相色譜分離純化得到4個組分（G1、G2、G3和G4），選取含量最高的G1和G3進行DPPH清除率測定，其中G1組分抗氧化活性最強，質量濃度為1 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到32.67%，利用ESI-MS/MS對G1組分抗氧化肽進行一級序列鑒定，得到含量最高和活性最強的10種抗氧化肽序列，其序列為RAELSEDDVFVIPA、LSEDDVFVIPA、DVFRAIPSEVL、FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH、LAVLI、SFEWVLEH、GIFGM、QVFL、FPF，得出SFEWVLEH的活性最強，其DPPH清除率為46.66%。