不同年齡大鼠尿液代謝組學研究

楊玉萍 張霞 王翀翀 王曉艷

（上海交通大學系統生物醫學研究院 系統生物醫學教育部重點實驗室，上海 200240）

生長、發育和衰老是極為復雜的生理過程，伴隨著分子、細胞和器官等多個因素的改變，最終導致機體在代謝、功能和健康狀態方面發生系列變化［1-2］。年齡與代謝改變具有密切關系，年齡增加導致的慢性低度炎癥和腸道菌群改變可引起代謝失調，而代謝失調進一步促進與年齡相關的疾病的發生與發展［2-4］。

代謝組學是現代系統生物學的一項關鍵技術，專注于獲取與生理和病理過程相關的生物體當前代謝狀態的完整描述［5］，已被廣泛應用于不同生物年齡相關的代謝規律研究中。Copes等［6］利用代謝組學方法檢測到隨著Caenorhabditis elegans年齡的增長，游離脂肪酸和山梨醇水平升高，嘌呤和嘧啶相關代謝物以及疏水性氨基酸水平降低，預示著改變的脂代謝、糖代謝和核苷酸代謝。人群實驗發現脂質代謝物，氨基酸代謝物如組氨酸、賴氨酸和蘇氨酸以及檸檬酸循環相關代謝物隨著年齡的增長發生顯著變化［7］。在課題組已發表的成果中，我們利用代謝組學方法研究大鼠各個腦區和血清代謝隨年齡增長的變化規律，發現年齡顯著改變了腦和血清代謝，特別是脂肪酸和氨基酸類代謝物［2，8］。

尿液是一種重要的、易于獲取的生物樣本，采集成本低，無創，且不需要訓練有素的專業人員，因此成為了臨床使用的理想生物液體［9］。本研究利用氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC/TOF-MS）對不同年齡大鼠的尿液樣本進行代謝組學檢測，探究年齡對大鼠尿液代謝的影響，為揭示尿液代謝譜的隨年齡增長的變化規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 潔凈級Wistar大鼠14只（雌雄各7只），4周齡，均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

1.1.2 實驗試劑 色譜純甲醇購于Merck公司；尿素酶、分析純2-氯苯丙胺酸、分析純吡啶和分析純甲氧胺購于 Sigma-Aldrich 公司；硅烷化試劑BSFTA（含1%TMCS）購于安普生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（氣相色譜儀型號為 Agilent 6890N，飛行時間質譜儀型號為 Leco Pegsus HT）；大鼠新型代謝籠（蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司）；Forma-86℃超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；XS105內校分析天平（美國Mettler toledo公司）；5415R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；H-101渦旋儀（上海康禾光電儀器有限公司）；DHG-9123A恒溫干燥器（上海精密實驗設備有限公司）；Milli-Q advantage超純水系統（美國Millipore公司）；LNG-T88臺式快速離心濃縮干燥器和LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器（太倉市華美生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠飼養與樣本收集 將14只4周齡的Wistar大鼠（雌雄各7只）單籠飼養，所有操作嚴格按照中國法律、地方規定和實驗動物倫理規范執行。待大鼠8周齡即成年后，雌雄隨機配對并合籠飼養，20 d后雌鼠生產。每窩隨機抽取6只新生雄性仔鼠隨機分配到各組。共42只新生雄性仔鼠分為7組，分別為出生后第3周、第5周、第7周、第9周、第12周、第56周、第111周（記為W3、W5、W7、W9、W12、W56、W111），每組各6只，如圖1。雄性仔鼠斷奶后，在3周齡時與雌性母鼠分籠飼養。所有實驗大鼠均提供充足標準大鼠飼料和無菌水，無菌水每2-3 d更換一次，飼養溫度為（24±1）℃，飼養濕度為（45±15）%，每天保持12 h光照與12 h黑暗。待各組仔鼠長到相應年齡點時，置于代謝籠中收集尿液樣本，樣本在室溫下以3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝后置于-80℃冰箱保存，用于后續檢測。

圖1 大鼠尿液樣本取樣時間點和年齡分段示意圖Fig.1 Schematic diagram of rat urine sampling time points and age segments

1.2.2 尿液樣本預處理與代謝物檢測 待各組樣本收集完成之后，將尿液樣本同時取出進行代謝組學檢測。本實驗尿液樣本預處理方法根據課題組已發表方法進行微調［10］，簡述如下：取100 μL尿液樣本與10 μL尿素酶（30 U/10 μL）充分混合，在37℃條件靜置15 min，加入2-氯苯丙氨酸溶液（溶于水，0.1mg/mL）10 μL作為內標，并加入300 μL甲醇渦旋混勻。4℃條件下13 200 r/min離心5 min，吸取300 μL上清移至進樣瓶中于室溫下進行真空離心干燥。然后加入甲氧胺（溶于吡啶，15 mg/mL）80 μL，密封并渦旋30 s混勻，37℃反應1.5 h，接著加入80 μL BSTFA（含1% TMCS），渦旋30 s混勻，70℃反應1 h。反應結束后渦旋10 s，室溫放置1 h用于后續上機檢測。質量控制（quality control，QC）樣品由所有原始尿液樣品混合后制備，預處理方法同上述各個尿液樣本。將各樣品隨機排列后上機檢測以減少系統誤差，進樣始末及每10次進樣安排QC樣本檢測。每個樣本吸取1 μL進行氣相色譜-飛行時間質譜檢測，條件如下：載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱升溫程序設置為80℃持續2 min→以10℃/min的速度加熱至140℃→以4℃/min的速度加熱至240℃→以25℃/min的速度加熱至290℃，持續4.5 min；進樣口、傳輸接口和離子源的溫度分別為：270℃、270℃和220℃；電離方式為EI，電子能量為70 eV；掃描范圍為30-600m/z，采集速率為20光譜/s。

1.2.3 數據統計分析 儀器檢測所得原始數據在Chroma TOF軟件（v4.51.6.0，LECO，USA）中經數據轉換、降噪、基線校準、峰識別和對齊過程，轉化為一套完整三維數據集（含樣本信息、保留時間和峰強度）。代謝物鑒定采用自建標品庫和商業譜庫，如HMDB（human metabolome database）數據庫和NIST（national institute of standards and technology）數據庫等。以相似度≥700、代謝物數據缺失值小于樣本總數的60%作為代謝物保留條件，矩陣經補零和歸一化后輸入SIMCA-P13.0（Umetrics，Sweden）軟件進行主成分分析（principle component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。因超過85%的變量為非正態分布，我們使用Kruskal-Wallis檢驗多組之間差異性，并使用Dunn’s post hoc test 和Benjamini-Hochberg 錯誤發現率（false discovery rate，FDR）進行多重檢驗。所有的檢驗均是雙邊檢驗，P值均通過FDR校正且默認P＜ 0.05為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 代謝組學輪廓分析

通過對不同年齡大鼠的尿液樣本進行GC/TOFMS檢測，共鑒定到110種代謝物，為描述各組大鼠尿液樣本的整體代謝組學差異，進行了PCA分析（圖2-A）和PLS-DA分析（圖2-B）。從圖2可以看出，QC樣本分布集中，說明儀器檢測過程穩定，重復性良好。PCA得分圖顯示，各年齡組尿液代謝可通過第一主成分或第二主成分明顯分開。無監督分析結果表明，年齡是影響健康大鼠尿液代謝的主要因素。所有年齡組的PLS-DA模型也證實了這一觀測結果。

圖2 大鼠尿液代謝輪廓散點圖Fig.2 Scatter plots of rat urine metabolism profile

2.2 代謝物類型統計

檢測到的110種尿液代謝物中，包括氨基酸類代謝物18種，碳水化合物類代謝物21種，脂肪酸類代謝物19種，有機酸類代謝物34種和其它代謝物18種。其中，氨基酸類代謝物、有機酸類代謝物和碳水化合物類代謝物是大鼠尿液樣本中的主要代謝物類型，合計占比超過74%，并且三者相對含量依次遞減。有機酸類代謝物在幼年（W3和W5）、成年（W7、W9和W12）和老年階段（W56和W111）的相對含量依次升高（圖3）。

圖3 不同年齡段尿液代謝物類型相對豐度圖Fig.3 Relative abundance of metabolite types in rat urine with different age segments

2.3 差異代謝物篩選

考慮到7周齡為大鼠生長發育的成熟階段，將其余各組均值分別與W7組均值作比較，并使用多重檢驗方法分析各組與W7組的差異性，按代謝物類型分別繪制差異倍數（fold change，FC）熱圖（圖4）。

圖4 所有尿液代謝物的差異倍數熱圖Fig.4 Fold change heatmaps of all urine metabolites

熱圖結果顯示，氨基酸類代謝物如2-哌啶甲酸（pipecolic acid）從W12開始相較于W7顯著升高，肌酸酐（creatinine）隨年齡幾乎呈現逐漸上升趨勢，與之相反地，L-賴氨酸（L-Lysine）、尿囊酸（allantoic acid）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、丙氨酸（Alanine）、4-羥基脯氨酸（4-hydroxyproline）、L-纈氨酸（L-Valine）、L-正亮氨酸（L-Norleucine）、蘇氨酸（Threonine）和L-絲氨酸（L-Serine）在幼年階段的大鼠尿液中水平較高，而后逐漸降低，特別是尿囊酸在W56和W111與W7相比顯著降低。

碳水化合物類代謝物如肌醇（myo-inositol）、丙 三 醇（glycerol）、D-葡 萄 糖（D-glucose）和D-甘露糖（D-mannose）在成年階段水平較低，在幼年和老年階段水平較高，2，3-二羥基丁酸（2，3-Dihydroxybutanoic acid）、山 梨 醇（sorbitol）、D-核 糖（ribose）、D-松醇（D-pinitol）和L-阿拉 伯糖醇（L-arabitol）水平與W7組相比，在老年階段均升高。相反地，甘油酸（glyceric acid）在老年階段出現顯著下降趨勢，另外，1，5-脫水山梨醇（1，5-anhydrosorbitol）在W3顯著升高，而海藻糖（trehalose）和核糖醇（ribitol）在W3顯著降低。

在有機酸類代謝物中，3，4，5-三羥基戊酸鹽（2-Deoxypentonic acid）、α-氧代戊二酸（oxoglutaric acid）、馬尿酸（hippuric acid）和烏頭酸（aconitic acid）的水平隨大鼠年齡增長而逐漸升高，其中，3，4，5-三羥基戊酸鹽和α-氧代戊二酸在老年階段顯著升高，富馬酸（fumaric acid）和蘋果酸（malic acid）水平也在老年階段升高，草酸（oxalic acid）水平隨年齡增長逐漸下降，其在W111的水平與W7相比顯著降低。尿液代謝物中多種有機酸類代謝物隨年齡增加先升高后下降，如苯甲酸（benzoic acid）、煙酸（nicotinic acid）、苯乙酸（phenylacetic acid）、琥珀酸（succinic acid）、丙酮酸（pyruvic acid）、犬尿酸（kynurenic acid）和吲哚乙酸（indoleacetic acid）等。與此相反的，5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid）隨年齡增長先下降后升高。

脂肪酸類代謝物如5-羥基己酸（5-hydroxyhexanoic acid）和2-甲基-3-羥基丁酸（2-methyl-3-hydroxybutyric acid）均在W3和老年階段相較于W7顯著降低，乙基丙二酸（ethylmalonic acid）和甲基琥珀酸（methylsuccinic acid）隨大鼠年齡的增長整體呈現逐漸上升趨勢，分別在W12和W111顯著升高。

其它類型的尿液代謝物如對苯二酚（hydroquinone）、3-乙基苯酚（3-ethylphenol）、乳清酸（orotic acid）和3-羥基苯乙酸（3-hydroxyphenylacetic acid）在幼年階段水平較低，在成年和老年階段水平升高，而脫氧胞苷（deoxycytidine）、尿酸（uric acid）、乙醇胺（ethanolamine）和胸腺嘧啶（thymine）則在幼年階段水平較高。5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）在成年期水平最低，相反的，5-羥基吲哚（5-hydroxyindole）在成年期水平較高，在幼年和老年階段水平顯著降低。

3 討論

本文利用GC/TOF-MS檢測到110種尿液代謝物，無監督的PCA分析和有監督的PLS-DA分析結果表明，各年齡點均可被第一或第二主成分完全分離，表示年齡是影響尿液代謝的主要因素。大鼠尿液代謝在生命周期中出現的隨年齡的變化，或可作為預測大鼠年齡段和生理病理狀態的依據。

氨基酸除了作為機體蛋白質和多肽的基本組成單位外，還參與調節生長、繁殖和免疫所必需的關鍵代謝途徑［11］。氨基酸類代謝物在尿液中水平極高，占比超過35%。2-哌啶甲酸作為賴氨酸分解代謝的產物，在遺蛋白缺陷癥、過氧化物酶功能障礙、高賴氨酸血癥和脯氨酸代謝缺陷癥等疾病中水平升高［12］。從W9起，L-賴氨酸水平逐漸降低，隨后從W12開始，2-哌啶甲酸顯著升高，這可能預示著年齡相關代謝疾病的發生。4-羥基脯氨酸是合成膠原蛋白的主要原材料之一，在幼年、成年和老年階段逐漸降低，與在血清中的變化趨勢一致［2］，這與膠原蛋白隨著年齡增加逐漸減少有關。必需氨基酸如L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、蘇氨酸以及其它氨基酸如丙氨酸、L-絲氨酸、L-正亮氨酸和尿囊酸均在幼年階段水平較高，而后逐漸降低。缺乏賴氨酸、纈氨酸和蘇氨酸將會導致大腦神經功能障礙和免疫缺陷［11，13］。L-絲氨酸及其代謝產物不僅被認為是細胞增殖所必需的，而且也是中樞神經系統特定功能所必需的［14］。

眾所周知，D-葡萄糖在細胞內的能量產生、儲存和調節以及糖尿病和肥胖的致病作用中起著核心作用，而D-甘露糖在某些蛋白質的糖基化過程中很重要［15］。這兩種代謝物與甘油和肌醇一樣，在幼年和老年階段的水平較W7組均有所升高。研究表明，D-核糖誘導蛋白質錯誤折疊從而對神經細胞產生毒性，腹腔注射D-核糖可導致小鼠空間學習與記憶障礙及大腦炎癥。我們的研究結果表明，D-核糖在老年階段水平遠高于其他年齡段，相比于W7組也顯著升高，這可能與神經系統功能衰退有密切關系。多元醇被認為對中樞神經系統具有潛在毒性［16］，我們在大鼠尿液中檢測到山梨醇水平從W12起顯著升高。

有機酸類代謝物總水平在幼年、成年和老年階段不斷升高。有研究發現，糖尿病腎病小鼠相比于健康小鼠尿液PH值變低，且隨著病情不斷進展，尿液PH值更低［17］。有機酸類代謝物總水平的不斷升高，或許與糖尿病等年齡相關代謝疾病有關。α-氧代戊二酸、烏頭酸、富馬酸和蘋果酸在W111周相對于W7升高，這些物質作為三羧酸循環的中間體，同樣在糖尿病腎病的小鼠尿液中檢測到水平升高［17］，大量排泄未利用的三羧酸循環中間體或許暗示老年大鼠能量產生障礙［18］。作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前體物質，煙酸水平隨年齡增加也出現先升高后降低的變化。NAD是表觀遺傳修飾、DNA損傷修復和衰老等關鍵細胞過程的重要調控因子，其水平在衰老過程中發生系統性下降，并導致年齡相關的功能衰退［19］，這也提示在膳食中添加NAD前體物質如煙酸或可改善健康和延緩衰老。

脂肪酸類代謝物在尿液中占比較少，僅約4%。大鼠尿液代謝結果顯示，乙基丙二酸和甲基琥珀酸水平在中老年階段顯著升高。研究表明，長期高水平的乙基丙二酸與至少兩種先天性代謝缺陷有關，包括短鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥和乙基丙二酸腦病［20］。甲基琥珀酸也被發現與先天性代謝缺陷如乙基丙二酸腦病、異戊酸血癥和中鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥有關［21-22］。

作為嘧啶核苷酸合成途徑的中間體，乳清酸在幼年水平較低，到成年和老年階段水平升高。在某些先天代謝途徑如嘧啶合成和尿素循環錯誤的患者中，會發生過多的尿乳清酸排泄［23］。尿酸是嘌呤代謝的最終氧化產物，作為一種非常重要的抗氧化劑，有助于維持血壓的穩定和抗氧化應激，被認為是人類和其他靈長類動物延長壽命和降低年齡特異性癌癥發病率的主要因素［24-25］。本研究中，尿酸隨大鼠年齡增長幾乎呈現逐漸降低趨勢。5-羥基吲哚在成年期水平較高，幼年和老年階段水平較W7組顯著下降，該物質是色氨酸的代謝產物，參與學習、記憶和中樞神經系統調節，可通過減輕氧化應激來保護線粒體功能［26］。

4 結論

本文利用代謝組學平臺對長達111周等7個年齡點的大鼠尿液樣本進行了全譜檢測，發現4-羥基脯氨酸、L-賴氨酸和尿酸等隨年齡增加逐漸下降，D-核糖、烏頭酸和富馬酸等在老年階段水平升高，而煙酸和5-羥基吲哚等在老年階段水平下降。該研究發現了與生長、發育和衰老有關的尿液代謝物，為揭示尿液代謝譜的隨年齡增長的變化規律提供了參考。