解淀粉芽孢桿菌分子遺傳操作及其應用研究進展

邱益彬 馬艷琴 沙媛媛 朱逸凡 蘇二正 雷鵬 李莎 徐虹

（1. 南京林業大學輕工與食品學院，南京 210037；2. 南京工業大學食品與輕工學院，南京 211816；3. 揚州日興生物科技股份有限公司，揚州 225601）

隨著合成生物學技術的飛速發展，越來越多的底盤微生物細胞被開發用于生物再制造中。作為一種重要的微生物細胞工廠，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），又名瓦雷茲芽孢桿菌，在多種工業酶（如蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和纖溶酶等）及化學品（如核苷酸、氨基酸和生物聚合物等）的生物制造中都具有廣泛的用途［1］。因其高效的胞外蛋白分泌能力，B. amyloliquefaciens在作為高效蛋白重組表達宿主菌方面展現出了巨大的發展潛力（圖1）。在近幾十年來，對該菌的研究主要集中在應用領域開發和生物發酵工藝過程控制等方面。隨著基因測序和精準遺傳操作技術的快速發展，在分子層面對B. amyloliquefaciens進行定向設計與改造越來越趨于成熟化。而本文通過介紹B. amyloliquefaciens的分子遺傳操作包括遺傳轉化、遺傳操作工具開發和應用，將為未來構建B. amyloliquefaciens微生物細胞工廠用于高附加值產品的合成提供有效借鑒。

圖1 利用解淀粉芽孢桿菌微生物細胞工廠合成不同生物基產品示意圖Fig. 1 Schematic diagram of different bio-based products synthesized by B. amyloliquefaciens cell factory

1 B. amyloliquefaciens遺傳操作工具研究進展

1.1 B. amyloliquefaciens中的質粒工具介紹

作為重要的微生物遺傳操作工具，枯草芽孢桿菌模式菌株的常用質粒如穿梭質粒pHY300PLK（復制蛋白RepB）、組成型表達載體pMA5（復制蛋白RepB）、誘導型表達載體pHT01和pHT43（復制蛋白RepA）、溫度敏感型質粒pDR（復制蛋白RepF）均可在B. amyloliquefaciens中使用（如表1所示），極大簡化了對該菌株的遺傳操作。表1對B.amyloliquefaciens菌株中所使用的常規質粒工具進行了匯總。除此之外，越來越多具有獨特功能的內源質粒在B. amyloliquefaciens中陸續地被發現，這為B. amyloliquefaciens的研究提供了新的分子生物學遺傳研究工具［3，10］。為克服質粒不穩定而實現外源基因的穩定表達，筆者利用內源質粒p2Sip的天然復制子和復制蛋白構建了適用于B. amyloliquefaciens的新型質粒pNX01，連續傳代100次后，質粒的損耗率僅為4%。這一結果表明攜帶有內源性復制子的pNX01具有很好的穩定性，并且它適合外源蛋白在B.amyloliquefaciens中穩定表達［4］。

1.2 B. amyloliquefaciens中重要的合成生物學基因元件介紹

除了質粒工具外，近年來對B. amyloliquefaciens研究過程中同樣積累了一批啟動子、SD序列、終止子等作為合成生物學重要的基因元件（表1）。根據作用方式及功能可分為兩類：組成型啟動子和誘導型啟動子。Liao等［11］通過RNA-seq數據分析對B. amyloliquefaciensXH7中的強啟動子進行了篩選，以半乳糖苷酶bgaB基因作為報告基因，篩選出了sigW基因的啟動子Pr2能夠有效的啟動外源基因的表達。黃酮素的ykuN基因的啟動子P41是通過構建啟動子探針載體從B. amyloliquefaciens基因組中篩選獲得的，該啟動子因具有較強的啟動活性，可作為高效特異性啟動子用于代謝途徑改造和異源蛋白表達中［12］。筆者以果聚糖酶為報告基因分別在B. amyloliquefaciensNB中 測 試 了PhpaⅡ、Pamy、PsrfA、PgsiB、Psig和Pvgb等組成型啟動子。結果表明PhpaⅡ具有較強表達強度，Pamy屬于中等強度啟動子，而PsrfA和PgsiB的活性較弱［13］。除此以外，P43啟動子在B. amyloliquefaciens中也被證實是一種特征明顯的強組成啟動子，被廣泛用于酶過表達和代謝工程［5］。在誘導型啟動子中，Pgrac（IPTG誘導型）、PxylA（木糖誘導型）和PsacB（蔗糖誘導型）已報道成功實現蛋白在B. amyloliquefaciens中高水平表達［9］。除了啟動子在轉錄水平能影響蛋白表達之外，核糖體結合位點（RBS）能夠提高翻譯起始率并最終影響蛋白質表達水平的關鍵基因元件。其中B. amyloliquefaciens中的α-淀粉酶的SD序列研究的較多［14］。Liao等［12］利用RBS Calculator v1.1對P41啟動子的RBS序列進行設計并優化后，最終實現了半乳糖苷酶活性提高了約200%，表明在翻譯水平上通過優化RBS序列能夠實現對蛋白表達強度的調控。轉錄終止子作為基因表達的重要調節步驟，能夠提高mRNA的穩定性和酶的表達同樣被應用于解淀粉芽孢桿菌系統中，目前研究報道最多的主要是α-淀粉酶的終止子Tamy、Tfd等［4］。在B.amyloliquefaciens中進行外源基因表達時，對終止子在轉錄過程發揮的作用研究的較少，而后續更多合成生物學元件挖掘將豐富和完善B. amyloliquefaciens這一操作平臺的運用。

表1 B. amyloliquefaciens中所使用的合成生物學基因元件Table 1 Synthetic biological genetic elements used in B.amyloliquefaciens

1.3 無痕基因組操作工具在B. amyloliquefaciens中的建立

隨著合成生物學的發展，高效的細胞工廠成為研究人員的迫切需求，建立快速、高效改造的分子生物學的操作也成為B. amyloliquefaciens研究的熱點。利用同源重組方法是B. amyloliquefaciens突變菌株的構建的主要研究方法。由于轉化方法不成熟，轉化率低使得基于PCR片段或不復制的整合型質粒介導的同源重組方式很難在該菌株中廣泛的運用［3］。為了不使用抗生素基因作為篩選標記，2010年，Zakataeva等［15］將溫度敏感型質粒首次運用到B. amyloliquefaciens中，與整合型質粒相比，借助溫敏型質?？稍诘蜏叵逻M行復制而提高溫度造成質粒丟失，極大地提高了同源重組成功率，依靠PCR篩選，建立了B. amyloliquefaciens的無標記基因敲除新方法。基于以上方法，楊慧林等［16］利用溫敏型質粒pKS1成功敲除了ptsG和ptsHI基因，考察了磷酸轉運系統（PTS）移除對菌株長特性及鳥苷產率的影響。而采用雙交換時借助第二次同源重組過程將質粒從染色體上移除的過程概率非常低，這使得利用溫敏型質粒敲除依靠PCR篩選雙交換轉化子的工作量大且十分的低效。而反向篩選標記（counterselectable marker，CSM）的發現很好的解決了上述的問題。位點特異性重組系統Cre/loxP是通過催化兩個loxP位點之間發生特異性重組，可以在敲除后通過重組消除抗生素標記。但這兩個loxP位點進行同組后仍會在基因組留下一段疤痕［17］。在B.amyloliquefaciens中含有嘧啶磷酸核糖轉移酶upp基因的菌株在5-FU底物上可引起宿主細胞死亡，而失去upp標記的突變菌株則可存活并易于篩選出來。Zhang等［18］以upp基因作為反向篩選標記，并結合溫敏型質粒pKSV7在B. amyloliquefaciensLL3中成功去除47 Kb的bae基因簇。利用該方法能夠在B.amyloliquefaciens中實現連續多基因無痕敲除，且極大提高重組菌的雙交換篩選效率。然而在使用upp作為反向篩選標記時，需要首先刪除宿主的upp基因，而開發不依賴于宿主基因型的CSM更容易進行無標記操作。PheS蛋白的A294G突變體可以在翻譯過程中將苯丙氨酸類似物（如p-Cl-Phe）錯誤地結合到細胞蛋白中，從而對細胞產生毒性。Zhou等［19］構建了反向選擇標記pheS*，該標記通過點突變的枯草芽孢桿菌168來源的苯丙氨酸tRNA合成酶α亞單位基因pheS，攜帶該突變體基因pheS*的B. amyloliquefaciens細胞能夠在5 mmol/L對氯苯丙氨酸存在下出現100%的死亡率。基于該反向篩選標記，Zhou等［19］成功在B. amyloliquefaciensSQR9中刪除了37 Kbbmy基因簇。筆者利用構建的pheS*反向篩選標記系統，成功將γ-PGA調控信號pgsR表達元件無痕整合到B. amyloliquefaciens基因組中，獲得的重組菌γ-PGA產量提升了8%［3］。借助這些反向篩選標記，已極大加快了在B. amyloliquefaciens中無痕基因組操作的進程。具體操作流程如圖2-B所示，采用溫度敏感型敲除質粒雖能夠顯著提高B. amyloliquefaciens中同源重組的效率，整個操作周期需要經歷單、雙交換兩輪篩選過程導致了操作周期較長（5 d以上）。

近年來，CRISPR-Cas已發展成為生命科學領域備受關注的熱點研究方向，基于這種簡單、靈活、高效的基因組編輯技術，人們可以按照意愿對工業微生物進行快速設計與改造。CRISPR-Cas9系統主要包含Cas9蛋白和sgRNA兩個組成部分［20］。其作用的原理主要通過表達sgRNA，使靶序列與基因對應的互補序列進行配對，而sgRNA中的其他序列則形成能夠被Cas9識別的莖環結構，在PAM（protospacer-adjacent motif）序列上游2-3堿基間將靶基因的DNA單鏈切斷。但大多數原核生物的基因組被切開后，會導致細胞死亡。在人為增加同源修復序列作用下，斷鏈的DNA能通過HDR（homologydirected repair）途徑進行準確的基因組重組。因此，通過將同源重組技術和CRISPR-Cas9技術相結合，構建含Cas9、sgRNA和同源修復序列HR在內的表達載體，就能對原核基因進行高效準確編輯［13］。近期，筆者首次針對B. amyloliquefaciens，開發了能夠快速對基因組多基因無痕修飾的CRISPR-Cas9 Nickase（CRISPR-Cas9n）雙質粒系統（圖2）。該雙質粒系統由IPTG誘導的Cas9n表達質粒（pNXCas9n）和溫度敏感型質粒介導到的sgRNA表達元件（pDR-gRNA）組成。通過選擇upp基因作為報告基因，在B. amyloliquefaciensNB中的敲除效率實現了100%［13］。與pheS*介導的同源重組敲除相比，該CRISPR/Cas9n系統包括質粒轉化、基因編輯和質粒消除等整個操作過程均可在4 d內完成（圖2-B）。除了更高的基因編輯效率外，CRISPR-Cas9n系統具有操作方便、可連續進行基因敲除等優點，可作為B. amyloliquefaciens基因組操作強有力的工具。為滿足在B. amyloliquefaciens中實現多個靶向基因的基因表達調控的需求，筆者進一步開發了基于dCas9的基因沉默技術CRISPRi系統，該系統的關鍵作用元件為dCas9蛋白以及靶基因的sgRNA以實現dCas9蛋白對靶基因在轉錄水平的穩定的抑制。以增強型綠色熒光蛋白EGFP基因為報告基因，通過設計sgRNA靶向EGFP表達框的不同位置，EGFP的表達水平被調控到原來的28%-68.7%（圖3），該結果證實CRISPR-dCas9系統可以在B. amyloliquefaciens中實現基因表達水平的可控調節［21］。綜上所述的工具建立將為完善和推動B. amyloliquefaciens平臺用于生物制造提供重要保證。

圖2 CRISPR-Cas9n基因編輯技術在B. amyloliquefaciens中的操作流程示意圖Fig. 2 A schematic diagram of operation while CRISPR-Cas9n gene editing technology in B. amyloliquefaciens

圖3 CRISPR-dCas9n基因沉默技術在B. amyloliquefaciens中的構建Fig. 3 Construction of CRISPR-Cas9n gene silencing technology in B. amyloliquefaciens

2 解淀粉芽孢桿菌遺傳轉化的研究進展

高效的遺傳轉化系統的建立通常是在微生物進行分子生物學操作的基礎。而對野生型B.amyloliquefaciens菌株的遺傳操作時通常受限于轉化這一步驟。影響B. amyloliquefaciens轉化的因素主要有3個：（1）大部分B. amyloliquefaciens無法自發形成感受態，這嚴重限制了該宿主進行遺傳操作。（2）B. amyloliquefaciens往往具有分泌多糖或γ-聚谷氨酸等胞外聚合物的特性，這給感受態菌體的收集和外源質粒的轉化帶來嚴重的影響。而通過優化轉化過程培養時間，將菌體OD600控制在0.2-0.6之間來進行菌體的收集和感受態的制作，則很大程度上可以避免胞外聚合物對感受態制備產生的不利影響［3］。（3）B. amyloliquefaciens自身的限制性修飾系統也會影響外源質粒的轉化效率。筆者前期工作中發現，從E. coliDH5α（Dam和Dcm甲基化酶修飾）宿主中抽提的質粒均無法實現B.amyloliquefaciens的轉化，而先轉到甲基化酶缺陷型E. coliGM2163菌株中對質粒進行去甲基化處理則大大提高了B. amyloliquefaciens的轉化效率，這一操作同樣發也適用于其它芽孢桿菌的轉化。目前關于B.amyloliquefaciens的轉化方法主要有化學法、原生質體轉化和電轉化法（表2）。

表2 不同方法轉化B. amyloliquefaciens轉化效率的研究Table 2 Study on the transformation efficiency of B. amyloliquefaciens by different methods

2.1 電轉化法

電轉化法因具有較高的轉化效率而被廣泛的使用芽孢桿菌的轉化中。1999年，一種在以不同濃度的甘露醇和山梨醇作為滲透壓保護劑進行改進的電轉化方法使得枯草芽孢桿菌的轉化效率達到1.4×106轉化子/μg DNA，該轉化方法的建立成為了革蘭氏陽性菌電轉化法的一個里程碑［24］。此后對B. amyloliquefaciens的轉化方法都是在此方法的基礎上改進或通過添加不同的細胞壁弱化劑而建立的。2011年，Zhang等［22］通過在高滲培養基中添加弱化細胞壁的DL-蘇氨酸或甘氨酸，使得B. amyloliquefaciensTA208電轉化法的效率達到（8.94±0.77）×105CFU/μg。有研究報道，在B.amyloliquefaciens中主要存在著R.BamH I/M.BamH I系統，凡含有未經甲基化修飾的GGATCC片段的DNA往往會受到自身的限制性修飾系統的降解而無法轉化到B. amyloliquefaciens中。筆者通過移除了B. amyloliquefaciens菌株中自身的BamH I限制酶系統后，使用溫度敏感型質粒pDR和高拷貝質粒pMA5進行轉化效率測試，經電轉條件優化后改造NB菌株轉化效率分別提高了100倍和174倍，分別 達 到（4.94±0.42）×104和（6.15±0.19）×103CFU/μg DNA［3］。在B. amyloliquefaciens菌株的轉化中，電轉化因操作簡便、轉化效率高等優點已成為B.amyloliquefaciens菌株轉化最有效方法之一。而近年來針對高效電轉化條件探究為進一步實現菌株的遺傳改造提供了有效保障。

2.2 原生質體轉化法

作為外源基因導入細菌的常規方法，聚乙二醇（PEG）誘導的原生質體轉化同樣在B.amyloliquefaciens中有過研究報道。Akamatsu等［25］在B. amyloliquefaciens中首次嘗試了PEG介導的原生質體轉化的方法，成功實現了克隆質粒pTP4的轉化。為進一步提高B. amyloliquefaciens原生質體轉化效率，通過原生質體再生制備和PEG誘導轉化條件進行了優化，最終實現原生質體轉化效率達到了（2-4）×105CFU/μg［23］。原生質體轉化作為一種比較穩定高效的遺傳轉化體系，可能為某些轉化困難的野生型B. amyloliquefaciens菌株提供了新的研究手段。

2.3 化學轉化法

研究表明，在芽孢桿菌感受態形成過程中，ComK基因能夠促進細菌對外源DNA的吸收、重組修復及細胞分裂等，是負責調控感受態形成的關鍵調節因子。而通過在野生型B. amyloliquefaciens菌株中表達ComK基因，使ComK達到一定的閾值，則有利于細胞形成感受態并實現外源質粒在野生型B.amyloliquefaciens中的轉化［2］。在B. amyloliquefaciens中通過木糖誘導啟動子誘導表達枯草芽孢桿菌來源的ComK基因來人工誘導感受態形成，在最優條件下質粒DNA的轉化效率在［（129±20.6）-（1.7±0.1）］×105CFU/μg之間［2］。該工作建立的一種高效的B. amyloliquefaciens菌株化學轉化新方法，為后續的基因功能研究提供強有力的技術支撐。

3 B. amyloliquefaciens微生物細胞工廠應用的研究進展

3.1 B. amyloliquefaciens用于外源蛋白重組表達的運用

作為多種食品工業酶的生產菌株，B. amyloliquefaciens因擁有極強蛋白分泌能力常被作為外源蛋白表達的理想宿主。目前，已有多種淀粉酶、蛋白酶等已成功實現在B. amyloliquefaciens的異源重組合成。高溫球菌來源的α-淀粉酶（PFA）具有耐熱性、半衰期長和在低pH條件下的最佳活性，在淀粉加工方面具有巨大的工業應用潛力。在實驗中通過對影響表達的因素包括基因密碼子偏好性優化、啟動子優化、表達宿主菌株選擇等策略，最終在B. amyloliquefaciens進行異源表達，PFA的產量達到2 714 U/mL，約為枯草桿菌和大腸桿菌的3 000倍和14倍［26］。孫娟娟等［27］在B. amyloliquefaciensBF7658中利用宿主自身的表達元件成功實現了Bacillus deramificans普魯蘭酶的分泌表達。除淀粉酶外，多種蛋白酶同樣在B. amyloliquefaciens中進行表達。為構建羽毛降解的工程菌，辛青龍等［28］以B. amyloliquefaciensTCCC111018為表達宿主，優化了來源于地衣芽孢桿菌ATCC 16580的角蛋白酶基因kerA，最終獲得的重組菌株在搖瓶發酵培養基中36 h酶活力達到1 361.54 U/mL，12 h內即可將羽毛全部降解。而在王慧等［29］的研究中，在高產中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株B. amyloliquefaciensK11中以克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因BcaprE為報告基因，對經適配性優化獲得的通用分泌表達盒PamyQSPaprE進行隨機突變文庫，篩選出了20株表達分泌強度較野生型更佳的突變株，為B. amyloliquefaciens高效分泌表達平臺奠定了基礎。

與大部分芽孢桿菌類似，蛋白質在解淀粉芽孢桿菌中的分泌主要依賴蛋白分泌的Sec途徑、Tat途徑和非經典分泌途徑等［30］。這些途徑引導蛋白分泌的信號肽元件為解淀粉芽孢桿菌胞外分泌表達提供了研究手段。在B. amyloliquefaciensNK-ΔLP中通過考察7個不同信號肽（SPamyE、SPbgls、SPbpr、SPnprB、SPnprE、SPwapA和SPyncM）對于果聚糖蔗糖酶的胞外分泌效率，其中SPyncM信號肽對于果聚糖蔗糖酶的分泌效率最高，達到89.9%［9］。筆者在B.amyloliquefaciensNBC中優化了SPamyQ、SPsacB、SPnpr、SPyncM和SPsacC等5個信號肽來強化果聚糖酶在B.amyloliquefaciens中的分泌表達，其中SPnpr信號肽具有較好的分泌效率［13］。鑒于不同信號肽對于外源蛋白的表達具有不同程度的影響，在實際使用時我們需要將異源表達蛋白和信號肽進行人工組裝與優化，以達到更高的宿主適配性。在未來針對B.amyloliquefaciens菌株開發基于高分泌效率的信號肽通用表達體系將進一步拓展該菌在蛋白胞外分泌表達方向的獨特運用。

3.2 工程改造B. amyloliquefaciens用于多種代謝產物的合成

3.2.1 γ-聚谷氨酸 γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種以谷氨酸單體通過γ-酰胺鍵連接而成的生物高分子，基于其獨特的生物活性，γ-PGA在日化、食品、環保、農業和飼料工業等領域均具有廣泛的應用［31］。為建立低成本、高效率的γ-PGA微生物發酵工藝，筆者從菊芋塊莖根部土壤中分離篩選到一株直接利用菊芋菊糖一步法發酵合成γ-PGA的生產菌株B. amyloliquefaciensNX-2S，進一步通過ARTP選育、發酵過程調控等研究建立了同步糖化發酵菊粉制備γ-PGA的新工藝［32-33］。鑒于該菌株能夠偏好性的利用菊粉粗提液作為碳源且無需添加谷氨酸，是γ-PGA合成與設計的理想工業化底盤微生物。通過進一步對該菌株參與菊粉水解、還原糖代謝和γ-PGA降解等涉及γ-PGA合成的多個代謝模塊進行系統改造，最終重組菌株的γ-PGA產量達到（32.14±0.38）g/L［13］。在此基礎上，筆者所在團隊圍繞多元分子量γ-PGA可控合成為目標，開發了以降解酶為“開關”調控產物分子量和濃度的新策略。設計的CRISPRi系統采用了多重sgRNA組合的策略來對γ-PGA降解酶pgdS進行動態調控，通過對降解酶的可控表達實現了多元分子量γ-PGA（高分子量：＞800 kD、中分子量：400-600 kD、低分子量：50-100 kD）的制備［21］。為進一步實現超低分子量γ-PGA的調控合成，進一步利用谷氨酸消旋酶基因racE和γ-PGA合成酶基因pgsA對γ-PGA的立體化學構型進行了調控，并通過耦合γ-PGA降解酶，成功實現了目前的工業化生產精度難以滿足超低分子量（＜10 kD）γ-PGA的合成［34］。該工作進一步拓寬了γ-PGA下游運用場景。

3.2.2 胞外多糖 作為一類重要的活性物質，B.amyloliquefaciens胞 外 多 糖（extracellular polysaccharide，EPS）近年來受到越來越多的關注。Zhao等［35］從B. amyloliquefaciensGSBa-1分離純化胞外多糖，純化后的EPS主要由葡萄糖單糖組成，通過核磁共振譜進一步證實為由一個三糖重復單元組成的α-葡聚糖，可能存在兩個α-（1→3）和一個α-（1→6）葡萄糖鍵。進一步研究發現該EPS具有較強的清除DPPH和羥基自由基的活性，以及中等的超氧陰離子清除和金屬離子螯合活性。這是對解淀粉芽孢桿菌產生的具有強抗氧化活性的葡聚糖的首次表征。Han等［36］篩選得到一株產多糖的B. amyloliquefaciensLPL061，該胞外多糖具有免疫活性、乳化性、和熱穩定性。Chen等［37］發現菌株B. amyloliquefaciensMD-b1所分秘的胞外多糖具有抑制胃癌細胞MC-4和SGC-7901的生長活性。Yang等［38］從B. amyloliquefaciensC-1中分離得到兩種水溶性胞外多糖組分EPS-1和EPS-2，純化后的EPS-1中葡萄糖/甘露糖/半乳糖/阿拉伯糖的相對比例為15∶4∶2∶1，分子量為79.6 kD，EPS-2中葡萄糖和甘露糖的相對比例為3∶1，分子量為19.8 kD。結果表明EPS-1具有較強的還原能力和自由基、陰離子清除能力，而EPS-2沒有檢測到抗氧化活性。這些研究都表明B. amyloliquefaciens胞外多糖在食品和醫療領域具有較好的應用前景。除此之外，B. amyloliquefaciens還發現能夠合成胞外果聚糖。Cai等［39］從B. amyloliquefaciensJN4中分離純化出一種β-2，6鏈低聚果糖levan，它由果糖和葡萄糖組成，包含一個β-（2，6）連接的Fruf殘基主鏈，每6個殘基上有一個單獨的2-連接的Fruf分支。此外，B. amyloliquefaciens所產的這種果聚糖對ETEC具有較強的抗黏附活性，可作為一種預防腹瀉的抗黏附劑。為了提高B. amyloliquefaciensNKΔLP合成果聚糖的產量，Feng等［40］通過移除6個蛋白酶相關基因、生物膜基質蛋白TasA和γ-PGA合成酶基因簇（PgsBCA），改造后的重組菌株的果聚糖產量提高了103%。果聚糖蔗糖酶SacB作為催化果聚糖合成的關鍵酶，研究表明Y237S的突變能明顯提高該酶催化合成果聚糖的效率［41］。通過在B. amyloliquefaciens中優化果聚糖蔗糖酶SacB的表達，最終果聚糖產量達到102 g/L［9］。目前對于B.amyloliquefaciens胞外多糖的篩選和結構鑒定相關工作研究的較多，未來對于這些多糖生理功能研究和運用領域的拓展將進一步提升B. amyloliquefaciens菌株在工業生物技術領域的應用潛力。

3.2.3 核苷酸類 目前市場上的核苷類產品，包括肌苷、鳥苷和腺苷等，大多數是通過芽孢桿菌屬進行發酵生產的。鳥苷（guanosine），又名鳥嘌呤核苷，在食品和醫藥工業中都具有重要的應用。Wu等［42］通過誘變獲得了一株B. amyloliquefaciens突變菌株，鳥苷產量可達20.82 g/L。何逵夫等［43］考察了鳥苷生物合成途徑中的3個關鍵酶編碼基因（prs，purF，guaB）的過表達對B. amyloliquefaciens發酵生產鳥苷的影響，結果表明prs和purF基因協同表達后鳥苷產量提高14.4%，糖苷轉化率增加6.8%。Liao等［44］通過解除嘌呤生物合成途徑的嘌呤操縱子和優化呼吸鏈的能量生成等手段，使得鳥苷產量提升了41%。除了鳥苷外，B. amyloliquefaciens同樣還是肌苷和腺苷等核苷酸類生產的重要生產菌株［45-46］，這為開發合成更多核苷酸類產品提供指導作用。

3.2.4 抗菌脂肽類物質B. amyloliquefaciens能夠生產多種次級代謝產物，具有很強的抗病抑菌作用。而報道最多的就是合成一系列抗菌活性的代謝物，脂肽（lipopeptides），常見的脂肽包括枯草表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin），這些合成的基因簇在B. amyloliquefaciens基因組都已被發現。Surfactin是一種功能最強的生物表面活性劑，在農業、食品和制藥等領域有著廣泛的應用。通過對B. amyloliquefaciensMD4-12菌株合成surfactin發酵過程進行響應面優化優化，surfactin產量達到1.25 g/L［47］。周澤宇等［48］在敲除了伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin）合成酶基因簇的菌株中，分別過表達了與Swarming相關的SwrC蛋白、可能的跨膜轉運蛋白YbfB和4′-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶Sfp，surfactin最高產量達50.17 mg/L。近期研究發現，納米鐵顆?？梢杂行г黾蛹毎さ耐ㄍ感詠碓鰪妔urfactin分泌，surfactin滴度由原來的4.93 g/L提高到7.15 g/L［49］。為提高iturin A抗生素環脂肽的積累，Dang等［50］在B.amyloliquefaciensLL3菌株中對iturin A生物合成基因進行改造，通過在itu操縱子的上游插入一個強組成啟動子C2up來實現轉錄的增強，最終iturin A的產量達到37.35 mg/L。另外，Sang-Cheol等［51］從石油污染土壤中分離出一株生物表面活性劑產生菌B. amyloliquefaciensLSC04，經鑒定該菌株主要合成的是fengycin脂肽類物質。為進一步提高野生型B.amyloliquefaciensES-2-4的豐原素（fengycin）產量，利用基因組重排技術，獲得了一株高產重組F2-72（FMB72）菌株，其豐霉素產量提高了8.30倍。采用熒光定量RT-PCR方法分析，FMB72菌株在轉錄水平上的豐霉素合成酶基因（fenA）表達量是ES-2-4野生型的12.77倍［52］。而通過建立兩個組成型啟動子P59和PrepU替換pps操縱子的原生啟動子同樣能夠提高解淀粉芽孢桿菌ES-2中豐霉素的產量［53］。為進一步明確codY、comA、degU和spo0A這些基因對于脂肽類生物合成的調控作用，分別敲除了B. amyloliquefaciensfmbJ菌株中的codY、comA、degU和spo0A基因，bacillomycin D的產量明顯降低，它們的缺失導致fmbJ代謝通路、群體感應系統和物質轉運系統轉錄本水平發生巨大變化。此外，敲除codY基因和degU基因對于surfactin產率均顯著提高，而調節因子CodY對fengycin的合成無顯著影響［54］。隨著越來越多的脂酰結構的被發現設計和技術平臺的完善，未來對于脂肽類新結構化合物的開發將成為新的關注點。

3.2.5 其它化學品B. amyloliquefaciens還能夠合成乙偶姻（acetoin）、2, 3-丁二醇（2, 3-butanediol）等這些生物基化學品。通過兩階段轉速調控在B.amyloliquefaciensFMME044菌株中獲得了51.2 g/L的乙偶姻［55］。Luo在采用適應性進化方法提高B.amyloliquefaciens菌株中乙酰丙酮的產量［56］。在王詩卉等［57］的研究者通過采用復合誘變篩選獲得最優突變株B. amyloliquefaciensH-5，最終乙偶姻產量達85.2 g/L。B. amyloliquefaciens同樣是2, 3-丁二醇的合成菌株，Yang等［58］分離到一株能產2, 3-丁二醇的GRAS菌株B. amyloliquefaciensB10-127，該菌株發酵96 h時2, 3-丁二醇的最大濃度可達92.3 g/L，產率可達0.96 g/L/h。而進一步過表達甘油醛-3-磷酸脫氫酶和2, 3-丁二醇脫氫酶提高B.amyloliquefaciens中2, 3-丁二醇的產量［59］。

4 結語

隨著現代科技的不斷進步與成熟，合成生物學近年來得到了迅猛發展，是未來生物制造的重要趨勢，前景十分廣闊。在過去十幾年的發展中，合成生物學領域圍繞基因合成、基因編輯和基因組裝、生物元件挖掘及應用、人工合成生物體系的建立和重構等方面積累了一定的工作。B. amyloliquefaciens是一類能夠合成生物活性化合物包括蛋白、脂肽、氨基酸、核苷酸和胞外多糖等重要的平臺化微生物，在食品、農業、日化和醫療領域都有較為廣泛的應用（表3）。長期以來，由于B. amyloliquefaciens的轉化體系不完善、操作平臺不成熟使得該菌株在代謝工程改造方面的研究遠遠落后于其他芽孢桿菌屬。近年來隨著合成生物學技術和CRISPR遺傳操作工具的迅速發展，解淀粉芽孢桿菌菌株用于合成生物學“智造”的潛力逐漸被挖掘。未來針對B.amyloliquefaciens開展更多產物的人工合成通路設計和代謝網絡重構、底盤的適配性組裝與優化等，將進一步豐富該底盤菌株在生物工程領域中的運用。

表3 基于B. amyloliquefaciens合成的生物基產品匯總Table 3 Summary of the synthesis of biobased products based on B. amyloliquefaciens species