基于網絡藥理學和分子對接技術探討活血化瘀方治療糖尿病足的作用機制

賀偉平，黃春

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055

糖尿病是世界上最普遍的疾病之一，并且與高死亡率指數相關，其主要并發(fā)癥之一是糖尿病足［1］。糖尿病足臨床表現為糖尿病患者下肢缺血或下肢神經病變，產生足部潰瘍或組織病變，感染或不感染，嚴重者需要截肢或者導致死亡［2］。古籍最早記載糖尿病足為“脫癰”，后更名為“脫疽”［3］。發(fā)病通常在足趾，呈赤黑色。在中國，50 歲以上的糖尿病人中有8.1%患有糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer,DFU），截肢率和死亡率據估計為22%和11%［4］。針對此病，西醫(yī)采用手術或非手術的方式治療，比如：控制血糖、調節(jié)代謝、增加足部血液微循環(huán)，減少感染等等［5］，但效果不佳，且治療費用高昂，對患者家庭的經濟造成一定的困難。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，關于DFU 的研究和中醫(yī)診療取得了很大的進展。中醫(yī)治療DFU 主要從以下幾個方面入手：中藥外治、針灸推拿和按摩、中藥內服等［5］。中藥外治包括外洗、膏藥貼敷、藥粉箍圍、中藥濕敷等。有學者通過數據挖掘發(fā)現對于糖尿病足的外治方法多為活血祛瘀類、祛風除濕類以及清熱消腫等藥物［4,6］。

本研究采用的活血化瘀方是綜合歷代中醫(yī)多年臨床經驗，在黃芪桂枝五物湯基礎上加減而成，含黃芪30 g、桂枝10 g、三七30 g、丹參20 g、雞血藤20 g、牛膝15 g、桑枝10 g 和甘草10 g 八味藥。黃芪是補益類中藥，可利水消腫，托毒生肌。桂枝溫通經脈，助陽化氣。有研究證明黃芪和桂枝配伍可以降低糖尿病足患者的血糖，降低機體炎癥［7］。三七化瘀止血，活血定痛，常治療跌打損傷，瘀血腫痛。研究表明三七總甙對糖尿病足患者具有很好的改善作用，可改善缺血病況，提高患者的康復速度［8］。丹參活血祛瘀，涼血消癰，臨床研究表明丹參注射液對糖尿病足的治療具有較好的療效［9］。雞血藤具有活血補血，舒筋活絡之功效，有研究表明，雞血藤水提物能改善糖尿病足大鼠模型的潰瘍，降低炎癥因子水平［10］。藥典記載牛膝可以逐瘀通經，補肝腎，強筋骨；桑枝可以祛風濕，利關節(jié)；甘草可調和諸藥，并能預防糖尿病并發(fā)癥。

雖然目前尚無其他已發(fā)表的研究關注本活血化瘀方對糖尿病足的治療效果，但是該方是經萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院（以下簡稱我院）專家協定而成，又經我院小樣本臨床實踐證明其對DFU 的作用效果良好，所以該方具有很好的研究價值。本研究采用網絡藥理學和分子對接技術，探討本組方對糖尿病足的藥理機制。基于“成分-靶點-疾病”的互作網絡揭示藥物和疾病之間的聯系，活性成分和疾病之間的聯系，通過分子對接技術驗證成分靶點之間的作用力，為后續(xù)復方制劑的進一步開發(fā)和臨床應用提供參考。

1 方法

1.1 活性成分收集和靶點篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分別檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化學成分。根據一定條件進行篩選，即口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18，得到該組方的有效成分，然后在數據庫里得到有效成分相對應的靶點，在Uniprot 數據庫將靶點轉換成對應的基因靶點。

1.2 化合物-靶點網絡的構建

將“1.1”方法中收集到的成分和靶點構建相互作用網絡以了解活血化瘀湯活性成分和對應靶點之間的關系。利用Cytoscape 3.9.0 軟件制作網絡圖。

1.3 疾病靶點收集

以“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、TTD數據庫中搜索糖尿病足的相關靶點。刪除重復的靶點，在Uniprot數據庫將靶點轉換成對應的基因靶點。

1.4 共同靶點的篩選

利用Venny 2.1.0 在線平臺分析“1.1”方法中收集到的成分靶點和“1.3”方法中收集到的疾病靶點，取交集，即為活血化瘀方作用于疾病的共同靶點。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網絡的構建及核心作用蛋白的篩選

將交集靶點導入STRING 數據庫繪制PPI 網絡圖。將網絡圖導入Cystoscope 軟件進行結果分析，根據度值排名統(tǒng)計，得到藥物與疾病交互靶點中的核心關鍵靶點。

1.6 關鍵靶點GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

為了研究活血化瘀方治療DFU 的潛在分子機制，運用Metascape 數據庫，對上述獲得的關鍵靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。GO功能富集分析主要包括生物過程、細胞組成和分子功能三個方面。

1.7 “藥物-有效成分-靶點-通路”網絡的構建

利用Cytoscape 軟件，對活性成分、靶點與通路的結果進行綜合性分析，構建“藥物-成分-靶點-通路”網絡圖。

1.8 分子對接

根據“1.5”方法中得到的度值排名前3 的核心靶點蛋白及度值排名前3 的成分運用AutoDock軟件對兩者進行分子對接驗證。首先在PDB 數據庫中下載核心靶點蛋白的pdb 格式結構文件。在AutoDock 軟件中進行一定的操作，如加氫、去水等修飾該蛋白。然后在TCMSP 數據庫中下載化學成分的mol2 文件，利用AutoDock 軟件對其進行結構修飾。然后在AutoDock 軟件中進行分子對接。

2 結果

2.1 活血化瘀方活性成分及靶點的獲取

在TCMSP 數據庫中檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化合物，并按照“1.1”方法中的篩選條件收集化合物，共收集到212 個化合物，其中黃芪20 個，桂枝7 個，三七8個，丹參65 個，牛膝20 個，雞血藤24 個，桑枝3個，甘草92 個。剔除重復成分后共計212 個，重復成分如下表1。然后依次收集212 個成分對應的靶點，再合并去除重復的靶點，獲得290 個靶點，運用Uniprot 數據庫將相關靶點轉換成對應的基因信息。

表1 活血化瘀湯共同有效成分及對應靶點數目

2.2 成分-靶點相互作用

利用Cystoscope 軟件構建活血化瘀湯活性成分和靶點網絡，一共得到483 個節(jié)點，3 246 條邊。通過軟件計算所有節(jié)點度值，我們發(fā)現排名前三的成分為槲皮素，山柰酚和木犀草素。

2.3 糖尿病足的疾病相關靶點獲取

用“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”分別檢索Genecards、OMIM、TDD 數據庫獲得疾病靶點，在OMIM 數據庫以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得595 個靶點，以“diabetic foot”為檢索詞獲得601 個靶點，合并剔除重復靶點后共624 個。在TDD 數據庫分別用兩個檢索詞檢索到靶點20 個。在Genecard 數據庫以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得2 550 個靶點，以“diabetic foot”為檢索詞獲得4 839 個靶點。合并3 個數據庫的疾病靶點并剔除重復靶點后獲得5 349 個靶點。

2.4 交集靶點收集和PPI 蛋白網絡互作關系

利用Venny 2.1.0 在線平臺分析對復方靶點和疾病靶點取交集，如圖1 所示。205 個共有靶點或為活血化瘀湯治療DFU 疾病的靶點。將205 個交集靶點導入STRING 數據庫繪制PPI 網絡圖（圖2）。將205 個交集靶點和“2.1”收集到的活性成分相互關聯，剔除沒有交集靶點的成分，得到179個有效成分。將179 個成分和205 個交集靶點用Cystoscope 軟件進行分析，得出“成分-疾病靶點”網絡互作圖（圖3），根據度值排名，統(tǒng)計前10 的共表達基因靶點（表2）。

表2 度值排名前10的活性成分和交集靶點列表

圖1 活血化瘀湯活性成分靶點與DFU疾病靶點的共同靶點韋恩圖

圖2 活血化瘀方治療糖尿病足的靶蛋白PPI網絡圖

圖3 活血化瘀方活性成分與糖尿病足的交集靶點網絡圖

2.5 活血化瘀方治療DFU 的分子機制

利用Metascape 數據庫將“2.1”獲得的205 個共有基因靶點進行GO 和KEGG 通路富集分析。GO功能富集分析依照P 值大小排名繪制條形圖（圖4）。這些結果表明活血化瘀湯治療DFU 與細胞對氮化合物的反應、對無機物的反應和對異種生物刺激的反應活性等相關。KEGG 通路富集分析依照P 值大小排名繪制氣泡圖（圖5）。結果表明活血化瘀湯治療DFU 與調控脂質和動脈粥樣硬化，P13K-Akt信號等通路有關。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG信號通路富集分析結果

2.6 “藥物-有效成分-靶點-通路”網絡的構建

將含有活性成分、交集靶點、富集通路的excel數據表導入Cytoscape 軟件，構建“藥物-有效成分-靶點-通路”網絡圖。見圖6。

圖6 “藥物-成分-靶點-通路”網絡圖

2.7 分子對接驗證

將“2.4”結果中表2 里面度值居前3 位的活性成分槲皮素，山柰酚，木犀草素與關鍵靶點PTGS2、ESR1、HSP90AA1 對接，對接得分見表3。最低結合能越低說明靶蛋白與活性成分之間結合能力越好。以上結果表明ESR1、HSP90AA1 與槲皮素，山柰酚，木犀草素之間具有較強的結合能。PTGS2與槲皮素，山柰酚之間的結合較弱。以HSP90AA1為例，展示HSP90AA1 與3 個成分之間的結合如圖7。

圖7 HSP90AA1與槲皮素，山柰酚，木犀草素的分子對接圖

表3 度值排名前3的化合物與主要靶點對接情況 kcal/mol

3 討論

隨著我國人民生活水平的提高，我國糖尿病的流行趨勢不斷攀升，據《糖尿病流行病學調查研究》分析，成人糖尿病患者約占人口11%，嚴重加重了醫(yī)療負擔和患者的痛苦［11］。糖尿病足是糖尿病常見的并發(fā)癥，已發(fā)展成一個非常嚴重的公共衛(wèi)生問題［12］。自身的代謝管理、下肢運動康復治療及手術等方式是目前控制糖尿病足的主要方案［13］，但進程并不理想。近年來，隨著中醫(yī)藥不斷進步發(fā)展，國家也在出臺政策不斷鼓勵中醫(yī)藥的創(chuàng)新。有不少研究學者認為應用中藥治療糖尿病足有很好的治療前景。Zhou 等［14］研究發(fā)現中藥復方及相關藥理活性成分對于促進糖尿病創(chuàng)面愈合有積極作用。

DFU 屬于中醫(yī)的“脫疽”范疇。“脫疽”其名記載在南齊龔慶宣《劉涓子鬼遺方》沿用至今［3］。脫疽常見“苦渴、數飲、身熱”等為特征，其病機多以陰虛燥熱為主，漸至痰瘀內結。如《證治準繩》曰:“飲食起居，一失其宜，皆能使血瘀滯不行，故百病由瘀血者多”［15］。因此，采用活血化瘀療法可以 “截斷扭轉”，阻截疾病的惡化。對于不同類型的DFU 另可輔以清熱解毒、化痰軟堅、溫補脾腎等法，遵照脫疽的分期，根據疾病的主次側重，繼而調和臟腑功能，通暢氣血運行，扶正祛邪，從而起到治療作用［16］。

活血化瘀方是我院經過多年實踐探討的寶貴結晶，綜合多年臨床經驗在黃芪桂枝五物湯基礎上，去白芍、生姜、大棗加三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝、甘草，從而創(chuàng)立益氣活血、通絡化瘀的“活血化瘀方”。在臨床上已應用于糖尿病足的治療，該方在延緩潰瘍進程和促進潰瘍愈合方面都有良好的進展。本次研究結合網絡藥理學及分子對接等現代科學方法，深入探討活血化瘀方在DFU 方面的療效。中醫(yī)治療代謝性疾病具有多成分、多靶點的特點，這與網絡藥理學的特點不謀而合。網絡藥理學如今已成為研究中醫(yī)藥藥理基礎及其中藥作用疾病的作用機制研究的一個熱門工具，在中藥活性成分篩選、中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的作用機制闡釋等方面得到了廣泛的應用［17］。

本研究利用網絡藥理學篩選活血化瘀方有效活性成分179 個，可作用于糖尿病足的治療靶點205個。排名靠前有效成分分別是槲皮素、山柰酚和木犀草素這3 種黃酮類化合物，提示這些化合物可能是活血化瘀方干預糖尿病足的核心藥效成分。有研究發(fā)現，槲皮素可以加快糖尿病大鼠難愈性傷口愈合，其機制與促進傷口部位血管新生、肉芽組織增生、膠原纖維沉積，減輕傷口炎癥反應有關［18］。含有槲皮素殼多糖納米粒在修復皮膚方面也有功效［19］。研究表明，山柰酚和木犀草素對糖尿病及其并發(fā)癥的改善作用也很明顯。

根據PPI 網絡分析結果，發(fā)現PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等為關鍵靶點。PTGS2 蛋白在前列腺素生物合成、脂肪酸生物合成、細胞運動性、生理過程、血壓調控、環(huán)氧酶途徑、角化細胞分化、調控炎癥應答等方面發(fā)揮了重要作用。Estrogen receptor 是一種雌激素受體，研究發(fā)現它與女童糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關［20］。其中，PTGS2 和HSP90AA1 也是中藥復方益糖康防治糖尿病腎病的關鍵靶點［21］。而糖尿病腎病與DFU 病是糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的重要的并發(fā)癥。本研究表明，活血化瘀方干預DFU 的核心靶點與PTGS2、ESR1、HSP90AA1 有關。

GO 功能富集和KEGG 通路富集結果顯示活血化瘀湯治療DFU 與細胞對氮化合物的反應、對無機物的反應和對異種生物刺激的反應活性等相關，可能與脂質和動脈粥樣硬化，P13K-Akt 信號等通路有關。糖尿病病人中發(fā)生脂質和動脈粥樣硬化的概率明顯高于非糖尿病人，P13K-Akt 信號通路在糖尿病的治療機制中研究甚多。在糖尿病腎病的研究中，P13K 的表達是增多的［22］。綜合以上研究，我們可以得出活血化瘀方通過槲皮素、山柰酚和木犀草素等活性成分調控PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等靶點基因，進而調控脂質和動脈粥樣硬化，P13KAkt 信號通路起到治療DFU 的效果。本研究中，分子對接表示槲皮素、山柰酚和木犀草素對ESR1、HSP90AA1 靶點的結合較好，木犀草素對PTGS2 的結合較好，為后續(xù)進一步實驗驗證和處方開發(fā)提供了方向。