九味溫灸艾的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊寶蓮，吳建華，廖洲青

贛州市中醫(yī)院，江西 贛州 341000

九味溫灸艾配方源自元代王好古的《此事難知·易老解利法》的九味羌活湯的化裁方，在熱敏灸理論基礎(chǔ)上，結(jié)合贛州市中醫(yī)院（以下簡稱我院）針康科多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)該方進(jìn)行了數(shù)次修改優(yōu)化，并最終固定為我院協(xié)定處方，此后逐漸發(fā)展為我院特色中藥制劑。

此方是由艾絨、羌活、沉香、獨(dú)活、白芷、細(xì)辛、川芎、夏天無等9 味中藥材組成的復(fù)方制劑，具有溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)的功效，臨床上用于風(fēng)寒濕痹、肌肉酸麻、四肢關(guān)節(jié)疼痛、脘腹冷痛等癥［1-8］。

但因該協(xié)定處方由針康科醫(yī)師臨用前自行搓制，個(gè)體操作差異大，難以對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效的控制，且在使用、保管上均極為不便，為此，我們修改了該制劑的生產(chǎn)工藝。鑒于目前該標(biāo)準(zhǔn)缺少定性、定量等實(shí)質(zhì)性控制指標(biāo)，本研究參考了《中國藥典》2020 年版一部［9］及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)九味溫灸艾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，采用顯微鑒別法對(duì)九味溫灸艾中君藥艾絨進(jìn)行定性鑒別，使用薄層色譜鑒別川芎和羌活，采用HPLC 法測定九味溫灸艾中指標(biāo)性成分綠原酸的含量并制訂了含量限度。參照《中國藥典》2020 年版一部要求，對(duì)九味溫灸艾的重量差異和水分等項(xiàng)目進(jìn)行檢查，確保有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260 型HPLC 儀（紫外檢測器），超聲波清洗器（深圳冠博科技實(shí)業(yè)有限公司），萬分之一電子天平（mettler-toledo 公司），Saikedigital 顯微鏡，卡瑪薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：綠原酸（批號(hào)：110753-201817，含量96.8%），羌活醇（批號(hào)：111820-201705，含量99.9%），異歐前胡素（批號(hào)：110827-201812，含量99.6%）。對(duì)照藥材：羌活（批號(hào)：120935-201809），川芎（批號(hào)：120918-201813）。以上對(duì)照品/藥材均采購自中國食品藥品檢定研究院。九味溫灸艾（贛州市中醫(yī)院制劑室，批號(hào)20200301、20200302、20200303，規(guī)格：每支重28 g）。硅膠G 板（青島海洋，0.20～0.25 mm）。乙腈（色譜純）、水（超純水），其余試劑（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 艾絨的顯微鑒別 取樣品粉末，用水合氯醛裝片，置顯微鏡下觀測：可見T 形毛，頂端長而彎曲，柄2～4 細(xì)胞。見圖1。

圖1 艾絨顯微鑒別圖（×400）：A.批號(hào)20 200301；B.批號(hào)20 200302；C.批號(hào)20200303。

2.1.2 川芎的TLC 鑒別 取3 批樣品各約10 g，分別加入乙醚100 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL 使溶解，即得供試品溶液；另取川芎對(duì)照藥材0.5 g 及缺川芎陰性樣品適量，同法制成對(duì)照藥材溶液及缺川芎陰性溶液。

吸取上述5 種溶液各10 μL，照TLC 法操作，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出后晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離良好，陰性樣品無干擾。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，重現(xiàn)性良好，見圖2。

圖2 九味溫灸艾中川芎TLC圖

2.1.3 羌活的TLC 鑒別 取3 批樣品各約10 g，分別加入乙醚100 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄?.5 mL 使溶解，得供試品溶液；另取羌活對(duì)照藥材0.5 g 及缺羌活陰性樣品適量，同法制成對(duì)照藥材溶液及缺羌活陰性溶液；再取羌活醇對(duì)照品、異歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每l mL 各含羌活醇、異歐前胡素1 mg 的對(duì)照品溶液。

吸取上述7 種溶液各2 μL，照TLC 法操作，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴上1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離良好，陰性樣品無干擾。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，重現(xiàn)性良好，見圖3。

圖3 九味溫灸艾中羌活TLC圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相采用乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），按表1 進(jìn)行梯度洗脫，流速1 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

表1 色譜梯度洗脫

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對(duì)照品10.24 mg，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成濃度為19.824 6 μg/mL 的溶液，搖勻，即得。（2）供試品溶液制備：取樣品約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取（功率350 W，頻率40 kHz）30 min 后，取出放冷，再用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾后取續(xù)濾液，即得。（3）缺艾絨陰性溶液的制備：取缺艾絨陰性樣品同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺艾絨陰性溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。綠原酸的保留時(shí)間約在13.7 min，能與其他各峰基線達(dá)到較好分離，且缺艾絨陰性溶液無干擾。見圖4。

圖4 HPLC色譜圖：A.綠原酸對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺艾絨陰性溶液

（2）線性關(guān)系考察。分別量取綠原酸對(duì)照品溶液（濃度為39.649 3 μg/mL）1 mL、2.5 mL、4 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL 置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸，其回歸方程為：Y=76.078X-1.341 4，r=0.999 9，線性范圍為3.964 9～39.649 3 μg/mL。

（3）精密度試驗(yàn)。取對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次并記錄色譜圖，計(jì)算得出綠原酸峰面積RSD為0.97%，顯示儀器精密度較好。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。取九味溫灸艾樣品（批號(hào)：20200301）6 份，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，得出綠原酸含量RSD 為0.52%，顯示此法重復(fù)性較好。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h測定，綠原酸峰面積RSD 為1.95%，表示供試品溶液在24 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗(yàn)。取九味溫灸艾樣品（批號(hào)：20200301，每1 g 含綠原酸0.764 mg）6 份，每份約0.35 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液（濃度為0.287 3 mg/mL）1 mL 后揮干，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制加樣回收樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見表2。綠原酸回收率在98.92%～99.79%區(qū)間，平均回收率為99.33%，RSD為0.38%，表示本法準(zhǔn)確度高。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 樣品含量測定 取三批九味溫灸艾樣品（規(guī)格：28 g/支），按上述的方法測綠原酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

2.2.5 樣品含量限度的確定 對(duì)我院生產(chǎn)的3 批九味溫灸艾試樣中綠原酸的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果平均含量為21.4 mg/支。以平均含量的70%擬定含量限度標(biāo)準(zhǔn)為：本品每支含艾絨以綠原酸（C16H18O9）計(jì)，不得少于15.0 mg。三批樣品的含量均符合擬定限度。

3 其他檢查

參照《中國藥典》2020 年版要求對(duì)樣品重量差異、水分等項(xiàng)目進(jìn)行檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

4 討論

本研究對(duì)處方中的九味藥材均進(jìn)行了薄層鑒別研究，由于沉香、獨(dú)活、白芷、細(xì)辛、夏天無和制遠(yuǎn)志等六味藥材薄層鑒別不夠成熟，有待今后進(jìn)一步研究，暫未列入擬定標(biāo)準(zhǔn)；艾絨的顯微鑒別及羌活、川芎薄層鑒別方法重現(xiàn)性好、陰性無干擾，可作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究利用高效液相色譜法建立了艾絨中綠原酸的含量測定方法,結(jié)果顯示，方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)考察均符合中藥指導(dǎo)原則的要求，說明該方法可操作性強(qiáng)、專屬性好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定可靠，可為九味溫灸艾的質(zhì)量控制提供參考。