HPLC 法測定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量

眭榮春，李金林，周玉春，肖云，王志春

1.江西大自然制藥有限公司，江西 吉安 343000；2.江西納弗堂制藥有限公司，江西 宜春 336000

蘄蛇藥酒起源于明朝年間，胡卓人蘄蛇藥酒的制作技藝為江西省吉安市吉州區(qū)傳統(tǒng)醫(yī)藥和江西省省級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)之一。蘄蛇藥酒執(zhí)行質(zhì)量標準為部頒標準中藥成方制劑第五冊（標準號：WS3-B-1063-91）［1］，只有性狀、鑒別和常規(guī)制劑通則檢查項，無含量測定項目，在質(zhì)量控制中存在一定的缺陷。目前關(guān)于蘄蛇藥酒含量測定也未見文獻報道。為了更好地控制其質(zhì)量，本研究建立HPLC 法測定蘄蛇藥酒中兩種成分（馬錢苷酸和龍膽苦苷）的含量，以填補蘄蛇藥酒含量測定項的空白，更好地控制蘄蛇藥酒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ2200DB 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004B 型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；ESJ203-S 型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號為110770-202219，純度為98.1%），馬錢苷酸對照品（批號為111865-202005，純度為97.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院。蘄蛇藥酒（江西大自然制藥有限公司，國藥準字Z36020910，規(guī)格：每瓶裝500 mL；批號：20200501、20200502、20200901、20200902、20210201、20210501、20210701、20211101、20211102、20211201）。甲醇和乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為純凈水(杭州娃哈哈公司)；其余試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果［2-6］

2.1 色譜條件

采用Ultimate Plus C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，按表1 進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱定馬錢苷酸對照品16.15 mg、龍膽苦苷對照品25.70 mg，加甲醇制成每1 mL 含馬錢苷酸0.157 5 mg、龍膽苦苷0.252 1 mg 的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蘄蛇藥酒適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按蘄蛇藥酒處方組成除秦艽藥材外其余藥材，用白酒作溶劑，蔗糖為輔料，按蘄蛇藥酒的制備工藝和“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果如圖1 所示，待測成分的色譜峰分離度良好，陰性對照溶液對待測成分無干擾，表明該方法專屬性好。

圖1 高效液相色譜圖：A.對照品溶液；B.陰性對照溶液；C.供試品溶液

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱定馬錢苷酸對照品16.15 mg、龍膽苦苷對照品25.70 mg，加甲醇制成含馬錢苷酸濃度依次為0.012 60 mg/mL、0.031 5 mg/mL、0.063 0 mg/mL、0.157 5 mg/mL、0.314 9 mg/mL，含龍膽苦苷的濃度依次為0.020 17 mg/mL、0.050 4 mg/mL、0.100 8 mg/mL、0.252 1 mg/mL、0.504 2 mg/mL 的混合溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，建立回歸方程，得馬錢苷酸回歸方程為Y=7.0×106X-5 543.6，r=0.999 9，龍膽苦苷回歸方程Y=1.0×107X-19 909，r=0.999 9，表明馬錢苷酸和龍膽苦苷分別在0.012 60 mg/mL～0.314 9 mg/mL 和0.020 17 mg/mL～0.504 2 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密量取含馬錢苷酸0.157 5 mg/mL、龍膽苦苷0.252 1 mg/mL 的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積，結(jié)果馬錢苷酸峰面積RSD（n=6）為0.27%，龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）為0.26%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取蘄蛇藥酒（批號20211201），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣分析，分別測定馬錢苷酸和龍膽苦苷在0、2、4、8、12、24 h 峰面積，結(jié)果馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）分別為0.96%和0.40%，表明蘄蛇藥酒供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取蘄蛇藥酒（批號20211201），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果測得馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）分別為1.05%和1.26%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密量取已知含量的蘄蛇藥酒（批號20211201）六份，每份2.5 mL，分別置5 mL 量瓶中，各精密加入含馬錢苷酸0.246 1 mg/mL 和龍膽苦苷0.759 3 mg/mL 的混合對照品甲醇溶液1 mL，并加甲醇至刻度，搖勻。按“2.2.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積，計算蘄蛇藥酒中2種成分含量，結(jié)果見表2、表3，表明該方法的準確度高。

表2 馬錢苷酸回收率測定結(jié)果

表3 龍膽苦苷回收率測定結(jié)果

2.9 樣品測定

取10 批蘄蛇藥酒樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，計算2 種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 10批蘄蛇藥酒含量測定結(jié)果 mg/mL

3 討論

3.1 檢測成分的選擇

蘄蛇藥酒由蘄蛇（去頭）、秦艽、防風、當歸、紅花、羌活和香加皮等7 味中藥組成，具有活血通絡，祛風除濕的功效。其中秦艽為蘄蛇藥酒主要功效成分，秦艽化學成分復雜，一般認為環(huán)烯醚萜苷類是其主要有效成分之一，龍膽苦苷為秦艽中含量最高的化學成分，也是秦艽中主要活性成分及苦味成分，龍膽苦苷具有保肝利膽［7］、抗炎［8-9］、升血糖及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［10］；馬錢苷酸具有一定的抗炎活性，也為秦艽主要活性成分［11］。因此，為了更有效地控制成藥質(zhì)量，本研究采用了HPLC法測定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量。

3.2 流動相考察

本實驗參考了《中國藥典》2020 年版一部和相關(guān)文獻［2-6］，確定流動相以乙腈為有機相，并考察了不同濃度的磷酸和醋酸對蘄蛇藥酒供試品溶液中待測組分分離的影響，結(jié)果不同濃度的酸對分離效果影響不大，磷酸較醋酸對待測組分分離效果好，故選擇0.1%磷酸溶液為水相。

3.3 檢測波長的選擇

參考《中國藥典》2020 年版一部中秦艽含量測定項和相關(guān)文獻［2-6］，供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果馬錢苷酸和龍膽苦苷在254 nm波長處都有較大吸收，故選擇254 nm 波長作為檢測波長。

3.4 小結(jié)

本研究建立以高效液相色譜法測定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷含量的方法，方法簡便，結(jié)果準確，可對蘄蛇藥酒的質(zhì)量進行有效控制。通過對10 批蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷進行含量測定，馬錢苷酸和龍膽苦苷總量在0.213 mg/mL～0.411 mg/mL 之間，通過查詢制劑所用秦艽飲片的檢驗報告，可知馬錢苷酸和龍膽苦苷兩種成分含量差異較大，推斷是所用飲片含量不同而導致不同批次成品中這兩種成分含量差異較大。根據(jù)《中國藥典》2020 年版中秦艽飲片的含量限度以及在處方中的實際用量，按轉(zhuǎn)移率90%計算，推算蘄蛇藥酒中含秦艽以馬錢苷酸和龍膽苦苷總量計應不得少于0.135 mg/mL，10 個批次成品含量均大于擬定限度。本次研究仍存在不足之處，如缺少其他藥味有效成分的含量測定和指紋圖譜研究等，后續(xù)將進一步進行多成分定量分析和指紋圖譜研究，從而更全面地評價蘄蛇藥酒的內(nèi)在質(zhì)量。