穿心蓮內酯對細菌內毒素所致膿毒癥的體內外拮抗研究

童凌斐，胡建新

江西省人民醫院（南昌醫學院第一附屬醫院），江西 南昌 330006

由細菌引起的臨床危重感染特別是膿毒癥日益增多，盡管使用了包括碳青霉烯類在內的各種強效廣譜抗菌藥物，但感染患者的死亡率仍居高不下［1］。其原因可能與抗菌藥物在殺死細菌的同時會誘導釋放大量的內毒素引起全身炎癥反應和嚴重膿毒癥相關，從而導致臨床最終治療失敗［2］。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成成分［3］。巨噬細胞在內毒素的作用下釋放相關的炎癥因子，進而引發全身炎癥反應綜合征（SIRS）反應，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清炎癥因子白介素-6（IL-6）等炎癥因子濃度會升高［4］。作為中藥爵科植物穿心蓮有效成分之一的穿心蓮內酯，既往研究能有效減輕機體的炎癥反應［5］，從而提高臨床療效，但穿心蓮內酯所發揮作用的物質基礎并不十分明確，是否能直接中和或破壞內毒素結構的具體成分尚未明確，因此以其為例進行研究，進行體內外拮抗試驗，明確其相關作用，對未來防治膿毒癥具有重要的參考意義。

1 材料

1.1 試劑和藥物

鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，0.1～1.0 EU/mL）；脂多糖（LPS，美國sigma-aldrich公司，大腸桿菌0111:B4，批號L5293-2ML）；穿心蓮內酯（阿拉丁試劑上海有限公司）；RAW264.7 細胞（中國科學院上海生化與細胞研究所），內毒素檢測用水（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，EK0412）；TNF-α ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，EK0526）。DMEM 細胞培養基（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司），其余試劑均為分析純，所有實驗用水均為去離子超純水。

1.2 試驗動物與儀器

清潔級KM 小鼠50 只（體重18～20 g/只，南昌大學實驗動物中心，實驗動物許可編號：ncdx2019102，雌雄兼用，雌鼠未孕）；鱟試驗微生物快速檢測系統ELx808IU-SN（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）。

2 方法

2.1 體外中和內毒素實驗

首先將實驗分組為：LPS 組，LPS+穿心蓮內酯組，穿心蓮內酯對照組（40 μg/mL）。LPS 組作為陽性對照；LPS 組、LPS+穿心蓮內酯組中的LPS 劑量均為10 ng/mL；配置好為80、40 和20 μg/mL 的穿心蓮內酯濃度，再加入LPS 10 ng/mL 分別在37 ℃培養箱內孵育30 min 進行體外中和實驗，與LPS 組進行對比以探究穿心蓮內酯的作用。取孵育后樣品100 μL，每個樣品設6 復孔，每組樣品中的LPS 可通過鱟試劑動態濁度法檢測。被穿心蓮內酯中和的內毒素占加入的內毒素總量的百分比表示清除率：清除率=（內毒素總量-未被中和的內毒素量）/內毒素總量×100%。

2.2 穿心蓮內酯對LPS 刺激RAW264.7 表達細胞因子的抑制實驗

首先在DMEM 培養液中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 的鏈霉素和100 U/mL 的青霉素，于37 ℃含5% CO2的培養箱中培養。調整RAW264.7 細胞數為1×105/mL 在48 孔細胞培養板培養；其中0.5 mL細胞液/孔對小鼠巨噬細胞株RAW264.7 進行培養。

用10 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細胞1 h 后，之后分別加入80、40、20 μg/mL 的穿心蓮內酯，共同孵育4 h 取上清測相關的炎性因子，根據對應添加的穿心蓮內酯濃度的不同，觀察其對內毒素刺激RAW264.7 細胞表達細胞因子的抑制作用的量效關系，ELISA 法檢測培養液上清中TNF-α 和IL-6 的濃度。以LPS組作為LPS+穿心蓮內酯組的陽性對照。

2.3 穿心蓮內酯對LPS 攻擊小鼠的保護實驗

體重18～20 g/只的KM 小鼠雌雄各25 只，編號后隨機分組。分別設空白對照組，LPS 對照組，LPS+穿心蓮內酯組（高、中、低三個濃度）；每組10 只小鼠，穿心蓮內酯的藥物濃度分別為160，80和40 mg/kg，LPS：18 mg/kg。均 按300 μL/20 g 體積對所有小鼠進行注射，之后6 h 后去除眼球采血。同時檢測小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 濃度，分析LPS 攻擊小鼠的炎癥反應以及穿心蓮內酯在體內對LPS 的抑制和拮抗作用。

2.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 5 統計學軟件進行分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 體外中和內毒素實驗

與LPS 對照組比較，高、中、低劑量的穿心蓮內酯在體外均有不同程度的中和內毒素作用，測定值與對照組比較均顯著降低（見表1）。隨著穿心蓮內酯濃度的成倍升高，內毒素清除也增加，顯示穿心蓮內酯具有體外清除內毒素的作用。

表1 3種不同濃度穿心蓮內酯的體外中和內毒素試驗

3.2 穿心蓮內酯對LPS 刺激RAW264.7 的抑制實驗

抑制試驗中細胞上清液IL-6 和TNF-α 的Elisa 檢測結果如圖1 和2 所示。在空白對照組中，RAW264.7 細胞的培養上清液中IL-6、TNF-α 含量極低。當給予10 μg/mL LPS 刺激后，RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-α 含量顯著增高，分別達到75.3 pg/mL 和360.2 pg/mL，隨后分別與80、40、20 μg/mL 的穿心蓮內酯孵育時，三組治療組均能不同程度地降低RAW264.7 細胞分泌的IL-6 和TNF-α 含量。其中80 μg/mL 的穿心蓮內酯能顯著降低抑制試驗中的IL-6 和TNF-α 水平，分別對應降至23.2 pg/mL 和88.9 pg/mL 左右，結果表明穿心蓮內酯能抑制LPS 對RAW264.7 細胞產生的炎癥刺激作用，當其濃度越高時效果更顯著，各濃度組與LPS 組比較，均差異有統計學意義（均P＜0.001），并且各濃度組間也差異有統計學意義。

圖1 三種濃度的穿心蓮內酯抑制試驗中IL-6結果

圖2 三種濃度的穿心蓮內酯對抑制試驗中TNF-α結果

3.3 穿心蓮內酯對LPS 攻擊小鼠的保護實驗

給予小鼠尾靜脈注射18 mg/kg 的LPS，統計空白對照組、LPS 對照組、LPS+40 μg/mL、LPS+80 μg/mL 和LPS+160 μg/mL 各組小鼠注射6 h 后IL-6和TNF-α 含量來確定小鼠保護試驗的結果，統計數據如表2 所示。注射LPS 入體內6 h 后，LPS 對照組的血清TNF-α 和IL-6 濃度分別高達789.1 和897.5 pg/mL。給予穿心蓮內酯160 μg/mL 時，小鼠血清TNF-α 和IL-6 的數值明顯下降至LPS 對照組的TNF-α 和IL-6 濃度的四分之一以下，分別為168.3 和200.4 pg/mL。選取尾靜脈注射18 mg/kg 的LPS 來攻擊小鼠時，反饋穿心蓮內酯對其有保護作用，而且與濃度呈正相關，各濃度組間與LPS 比較，均差異有統計學意義（均P＜0.001），并且各濃度組間也差異有統計學意義。

表2 LPS三種濃度的穿心蓮內酯對LPS攻擊小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

表2 LPS三種濃度的穿心蓮內酯對LPS攻擊小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

4 討論

家兔法雖然是熱原反應檢查的首選，但只能定性且操作繁瑣，難以用于內毒素定量，故本實驗采用鱟試驗法，相對操作簡單［6］。膿毒癥所產生的炎性因子是感染性疾病發生過程中重要的組成部分，某種程度上可決定膿毒癥的轉歸，炎癥因子中TNF-α 和IL-6 相對較活躍［7］。有研究表明，在治療銅綠假單胞菌引起的膿毒癥患者時，穿心蓮內酯可減少侵襲的細菌數量，降低細菌感染所致上皮細胞乳酸脫氫酶的釋放及線粒體損傷，降低機體損傷程度［8］。本研究表明，穿心蓮內酯在體外可以一定程度中和內毒素；在對LPS 刺激RAW264.7 細胞的抑制實驗中，穿心蓮內酯濃度越高，IL-6 和TNF-α 相對清除越多；穿心蓮內酯對LPS 攻擊小鼠的保護實驗結果顯示，不同濃度的穿心蓮內酯均具有一定的抗炎作用，表明體內LPS 可被其有效清除，避免更大的炎癥連鎖級聯反應。

綜上所述，穿心蓮內酯可抑制或中和細菌的LPS 產生，可減少炎癥反應產生的IL-6 和TNF-α，從而減少炎癥風暴的產生，減少膿毒癥對相關臟器的損傷，為中醫輔助治療膿毒癥或膿毒癥休克提供理論依據，為后續的中西醫合璧治療提供新思路。