轉(zhuǎn)基因大豆MON87751品系特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法建立

劉二龍 鄭冠津 王毅謙 李志勇 魏霜 關(guān)麗軍 盧麗 蔣湘 劉金華 王振華

摘要 [目的]為完善我國轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法體系，建立轉(zhuǎn)基因大豆MON87751品系特異性實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。[方法]根據(jù)MON87751的3′端鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立MON87751品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，并測(cè)定該方法的靈敏度、特異性及可重復(fù)性。[結(jié)果]靈敏度測(cè)試顯示，其定量下限為40拷貝;重復(fù)性試驗(yàn)顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在可接受范圍內(nèi)。[結(jié)論]該研究建立的MON87751品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性良好，靈敏度高，有良好的可重復(fù)性，適合對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆MON87751品系進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

關(guān)鍵詞 實(shí)時(shí)熒光PCR;轉(zhuǎn)基因大豆MON87751;品系特異性

中圖分類號(hào) S 565.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）04-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishing an Event-specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified Soybean Event MON87751

LIU Er-long1，ZHENG Guan-jin1，WANG Yi-qian2 et al （1.Huangpu Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510730;2.Animal Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract [Objective]In order to improve the genetically modified detection method system in China，a real-time polymerase chain reaction （PCR） detection method specific to the genetically modified soybean MON87751 was established.[Method]The specific primer pairs and probe based on the sequence of the 3' adjacent region of MON87751 were designed and then the real-time PCR detection method was established.The specificity，sensitivity and repeatability were analyzed.[Result]The real-time PCR method was specific for detecting MON87751.The limit of quantification （LOQ） was 40 copies MON87751 genomic DNA.Repeatability of the established event-specific real-time PCR method was assessed and the relative standard deviation （RSD） was within the acceptable range.[Conclusion]The established event-specific quantitative real-time PCR method of MON87751 has good specificity，high sensitivity and good reproducibility，and is suitable for the identification of soybean MON87751.

Key words Quantitative real-time PCR;Genetically modified soybean MON87751;Event-specificity

基金項(xiàng)目 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017B020207008）;廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201704030125）;國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFF0215605）;南京海關(guān)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021KJ18）。

作者簡介 劉二龍（1978—），男，湖南郴州人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)植物分子鑒定研究。*通信作者，博士，從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)研究。

收稿日期 2021-04-06;修回日期 2021-05-24

大豆是一種富含蛋白與脂肪的糧食及油料作物。我國是世界大豆第一消費(fèi)國和進(jìn)口國，國產(chǎn)大豆難以滿足國內(nèi)市場(chǎng)消費(fèi)需求，故而大豆貿(mào)易逆差大，2019年大豆進(jìn)口量為8 851萬t[1]。

轉(zhuǎn)基因大豆MON87751由孟山都公司研發(fā)，其含有穩(wěn)定整合的cry1A.105和cry2Ab2表達(dá)盒[2]，主要產(chǎn)生Cry1A.105和Cry2Ab2兩種針對(duì)鱗翅目害蟲的殺蟲蛋白。MON87751于2014年在美國上市，目前在歐盟、澳大利亞、新西蘭、加拿大、日本、韓國、中國臺(tái)灣和美國等國家或地區(qū)獲得批準(zhǔn)允許用作食品、飼料或種植。為完善我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，筆者采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)平臺(tái)，根據(jù)MON87751 3′端鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)引物、探針，建立了MON87751品系特異性檢測(cè)方法，以期為實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因棉花MON88913、轉(zhuǎn)基因油菜DP-073496-4、轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-30-2、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米BT11、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、非轉(zhuǎn)基因大豆為黃埔海關(guān)技術(shù)中心購置及保存;大豆內(nèi)源基因植物凝集素基因（Lectin基因）和MON87751品系特異性外源基因雙基因陽性質(zhì)粒為黃埔海關(guān)技術(shù)中心構(gòu)建。

主要試劑：Primex Ex Taq（2×） for qPCR（TAKARA）;引物和探針工作液的終濃度為10 μmol/L（上海閃晶生物）;DNA提取試劑盒DP-305（北京天根）。

主要設(shè)備：實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI7500fast、ABI7500（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）;研磨機(jī)Tube Mill 100 control（德國IKA）;微量分光光度計(jì) nanodrop2000c（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。稱取100 mg研磨成粉末狀的樣品提取樣品中的基因組DNA，測(cè)定DNA濃度并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物組和探針設(shè)計(jì)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆MON87751品系3′端鄰接區(qū)序列（品系特異性片段），應(yīng)用Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針。選用內(nèi)源基因Lectin用于樣本核酸提取質(zhì)量監(jiān)測(cè)及定量分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系退火溫度及引物探針配比的優(yōu)化。采用TAKARA RR390酶系對(duì)不同體積的引物探針進(jìn)行優(yōu)化（25 μL體系）。A組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.5 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 1.0 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.3 μL。 B組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.4 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 0.8 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.7 μL。C組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.2 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 0.4 μL，模板2.0 μL和ddH2O 9.5 μL。

退火延伸溫度分別設(shè)置為60和58 ℃，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃（58 ℃） 34 s，40個(gè)循環(huán)，于60 ℃（58 ℃）收集熒光信號(hào)。

1.2.4 特異性測(cè)試。用“1.2.1”的方法提取“1.1”中樣品DNA為模板，陽性對(duì)照為Lectin-MON87751質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大米DNA，進(jìn)行特異性測(cè)試。

1.2.5 靈敏度測(cè)試。

將提取的Lectin-MON87751DNATE緩沖液稀釋至4 000000、400000、40000、4000、400、40和20拷貝/μL進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆MON87751實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，進(jìn)行靈敏度測(cè)試。

1.2.6 可重復(fù)性測(cè)試及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將提取的Lectin-MON87751質(zhì)粒DNA溶液加入TE緩沖液稀釋至4 000 000、400 000、40 000、4 000、400、40和20拷貝/μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)線性范圍測(cè)試及可重復(fù)性測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立及優(yōu)化

2.1.1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針設(shè)計(jì)。

通過分析轉(zhuǎn)基因大豆MON87751 3′端鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)的多組引物和探針，分析引物與探針的反應(yīng)效率、擴(kuò)增效果，最終選擇表1中的引物和探針建立MON87751品系特異性檢測(cè)方法。

2.1.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化。

在擴(kuò)增體系的退火溫度為58 ℃時(shí)，3組引物探針組B、A和C的擴(kuò)增曲線均擴(kuò)增良好，其中Ct值最小為B組（圖1）;溫度為60 ℃時(shí)，B、A和C 3組均擴(kuò)增良好，A和B組Ct值接近，C組Ct稍高，但3組引物探針Ct值較退火溫度為58 ℃時(shí)Ct值高（圖2）。因此，基于擴(kuò)增效率和經(jīng)濟(jì)性，考慮選擇B組體積配比、58 ℃作為退火溫度引物探針配比。

2.2 特異性測(cè)試 由圖3可知，采用MON87751品系特異性MON87751-F/R/P引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR時(shí)，其他農(nóng)作物材料DNA為模板的反應(yīng)均無典型熒光擴(kuò)增曲線，只有陽性樣品MON87751的DNA模板有典型熒光擴(kuò)增曲線，表明該研究的檢測(cè)方法特異性良好。

2.3 靈敏度測(cè)試、可重復(fù)性測(cè)試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

按“1.2.5”進(jìn)行7個(gè)濃度梯度擴(kuò)增，其最低檢測(cè)濃度為20拷貝/μL。擴(kuò)增曲線見圖4。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 按“1.2.6”進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆MON87751品系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果的Ct值見表2。根據(jù)表2中Ct值數(shù)據(jù)與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值建立線性回歸方程為y=-3.43x+42.12，擴(kuò)增效率95.55%（90%～110%），R2為0.99，表明該方法的線性相關(guān)性良好，擴(kuò)增效率滿足定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求（圖5），且在線性范圍內(nèi)，Ct值的SD為0.04～0.39，RSD為0.20%～1.27%（表2）。最低模板量40拷貝時(shí)，其RSD遠(yuǎn)小于25%，設(shè)定該方法的定量限為40拷貝。

3 討論

目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品多數(shù)國家均采用相應(yīng)的標(biāo)識(shí)管理制度，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)需要檢測(cè)方法的支撐。歐盟轉(zhuǎn)基因食品和飼料基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室有建立MON87751 5′邊界序列的PCR檢測(cè)方法[4]，但國內(nèi)尚缺乏該檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，其可監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程中探針發(fā)光基團(tuán)的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定性或定量分析[5-7] 。

品系特異性PCR（Event-specific PCR）檢測(cè)方法檢測(cè)的目標(biāo)序列是外源基因與植物基因組間邊界序列，甚至可以區(qū)分相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品系[8]，品系特異性檢測(cè)方法報(bào)道較早見于Bt11品系檢測(cè)方法的建立[9]，目前在轉(zhuǎn)基因品系鑒定中應(yīng)用廣泛[10-15]。

該研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆MON87751 3′端邊界特異性序列，基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)，設(shè)計(jì)引物和探針建立MON87751品系特異性檢測(cè)方法，定量下限為40拷貝，擴(kuò)增效率為95.55%，重復(fù)性測(cè)試顯示，各平行間樣品所得Ct的RSD均遠(yuǎn)小于25%，表明該方法特異性良好，靈敏度較高，具有良好的穩(wěn)定性，可為相關(guān)部門鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆MON87751提供方便快捷的方法。

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