葡萄新品種組織培養快繁技術研究

陳玉霞 邱建輝 谷峰

摘要 [目的]探索葡萄新品種快繁技術。[方法]以葡萄1年生枝條腋芽為外植體，研究葡萄無菌植株的建立，篩選叢生芽分化、幼苗生根培養基配方及試管苗移栽的適宜基質。[結果]腋芽可作為外植體并以0.1% HgCl2消毒9 min為宜，黑奧林、先鋒、紅富士3個供試品種的無菌植株獲得率為45.10%～60.00%;篩選出的叢生芽分化培養基配方為B5+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.10 mg/L + 蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L，3個葡萄品種的平均叢生芽分化數為4.14 芽/莖段;幼苗生根培養基配方為改良B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂 6.5 g/L+活性炭0.3%，試管苗生根率達100%，幼苗根多且粗壯，莖葉生長旺盛;以不同基質移栽試管苗，細河砂的移栽成活率最高，3個品種的幼苗成活率達86.67%～100%，其次為蛭石，幼苗成活率為71.67%～85.00%，而腐殖質土的試管苗成活率只有33.33%～43.33%，幼苗很少發新根。試管苗不經煉苗，可直接從培養瓶移栽到基質中。[結論]建立了一整套葡萄組織培養快速繁殖技術體系，可為葡萄新品種的快速繁殖、老品種的培養復壯提供依據。

關鍵詞 葡萄;腋芽;叢生芽分化;生根培養;移栽;細河砂

中圖分類號 S 663.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）04-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Tissue Culture Rapid Propagation Technology of New Grape Varieties

CHEN Yu-xia， QIU Jian-hui， GU Feng

（Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear Agriculture Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei430064）

Abstract [Objective]To explore the rapid propagation technology of new grape varieties.[Method]By using axillary bud of the annual branch of grape as explants， the establishment of grape sterile plantless， the medium formula of the differentiation of cluster buds and seedling root， the suitable substrate for transplanting test-tube seedlings were studied. [Result]The results showed that axillary bud could be used as explants and disinfected with 0.1% HgCl2 for 9 minutes. The sterile plant acquisition rates of three tested varieties were 45.10%-60.00%. The medium formula of cluster bud differentiation was B5 +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.10 mg/L + sucrose 20 g/L + agar 6.5 g/L， and the number of cluster bud differentiation of the three grape varieties was the above 4.14 bud per stem segment. The formula of seedling root medium was modified B5+IAA 0.10 mg/L+sucrose 20 g/L +agar 6.5 g/L+activated carbon 0.3%. On this medium， the rooting rate of test-tube plantlets reached 100%， the roots of seedlings were many and strong， and the stems and leaves grew vigorously. Transplanting the test tube seedlings with different substrates， and the transplanting survival rate of the fine river sand was the highest，and the survival rate of three varieties seedlings was 86.67%-100%， followed by vermiculite， the survival rate of the seedlings was 71.67%-85.00%，and the survival rate of test-tube plantlets in humus soil was only 33.33%-43.33%. Test-tube plantlets can be directly transferred from the culture bottle to the substrate without refining them. [Conclusion]In this study， a set of tissue culture rapid propagation technology system of grape was established， which provided the basis for the rapid propagation of new grape varieties and the culture and rejuvenation of old varieties.

Key words Grape;Axillary bud;Cluster bud differentiation;Root culture;Transplanting;Fine river sand

葡萄（Vitis vinifera L.），葡萄科藤本植物，世界各地均有栽培，面積達1 000萬 hm2，占世界水果產量的30%以上[1]。葡萄既可鮮食，又可制葡萄干、葡萄汁或釀酒，還可作為美化庭園樓閣、綠化荒山堿灘的觀賞和綠化樹種。葡萄是世界最古老的果樹樹種之一。生產上通常采用扦插繁殖的方法繁殖葡萄苗木，易扦插成活，常規繁殖方法經濟有效[2]。但長期采用扦插繁殖，易導致品種退化、品質變劣，尤其在南方多雨地區，扦插苗易受病蟲感染，嚴重影響苗木質量[3]。植物組織培養技術就是將植物體的細胞、組織、器官采用無菌操作的方法，使其在人工條件及外源激素的作用下繼續生長，并分化發育成完整的小植株。該技術可用于新品種的快速繁殖，老品種的培養復壯，不受季節、地區、氣候、病蟲等因素影響，可周年進行生產[4-6]。葡萄組織培養最早始于1944年，morel.G 進行葡萄的離體培養，我國曹孜義等[7-9]先后開展了葡萄組織培養研究，其目的在于加快優良品種繁殖;之后國內普遍開展了葡萄莖尖（或莖段）組織培養的研究工作，

甘肅農業大學葡萄試管繁殖研究組經過一系列研究，實現了葡萄小型化育苗;黃貞光等[2]通過對葡萄離體培養接種、繼代繁殖、生根等研究，篩選出適合多個品種生長的廣譜培養基—— B5培養基;李國樹等[3]研究表明，外植體以莖尖為最佳，并對莖尖愈傷組織誘導、莖葉分化以及生根培養進行了研究。筆者選取當前推廣的優良葡萄品種1年生枝條腋芽為試材，對無菌植體的建立、叢生芽的分化、不定根的誘導以及試管苗的移栽等關鍵技術進行研究，以期形成一整套葡萄組織培養快速繁殖技術體系，為葡萄組培快速繁殖及大規模工廠化育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種。黑奧林、紅富士、先鋒，由湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所葡萄盆栽試驗基地提供。

1.1.2 主要設備。立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司;超凈工作臺（單人單面垂直送風），蘇州江東精密儀器有限公司;光照培養箱，蘇州長留凈化科技有限公司;三角瓶、移液管等玻璃儀器，北京博美玻璃儀器廠;組織培養室。

1.1.3 化學試劑。B5培養基、蔗糖、瓊脂、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、氯化汞或次氯酸鈉、乙醇等。

1.2 方法

1.2.1 取材和消毒。取盆栽葡萄1年生枝條，去除葉片，放入冰箱（4 ℃左右）保存7 h后取出，切成帶1個節的莖段，再對莖段進行消毒。首先用0.1%洗衣粉溶液漂洗10～15 min，洗凈材料表面的污染物。用紗布將莖段包好，懸于水龍頭下，小水流沖洗20 min，用濾紙吸干莖段的水分。將莖段轉入無菌三角瓶中，用0.1% HgCl2（加吐溫）消毒8～10 min。消毒時，不斷振動容器，使HgCl2與莖段充分接觸。最后用無菌水沖洗3～4次，每次洗滌1～2 min，備用。

1.2.2 腋芽的接種。在超凈工作臺上，將已消毒的莖段放在無菌濾紙上吸干水分，用解剖刀小心切取帶少部分莖組織的腋芽，接種到裝有芽生長培養基的3瓶中，每瓶接種3個腋芽，以腋芽剛好接觸培養基為宜。在培養過程中，觀察記錄腋芽的生長情況，及時剔除帶菌材料。

1.2.3 叢生芽分化培養基配方。以B5為基礎培養基，分別添加不同濃度的NAA和6-BA配制成不同的培養基，接種3個供試品種的無菌苗，置于光照培養室中培養，保持溫度25～28 ℃，光照時間12～16 h/d，光照強度2 000 lx。在培養過程中，每天觀察記錄叢生芽分化及生長情況，30 d后統計各品種叢生芽數等各項指標。

1.2.4 生根培養基配方。以改良B5為基礎培養基，分別添加一定濃度的IAA、蔗糖和活性炭配制成生根培養基，接種有2～3片真葉，生長基本一致的叢生芽，每品種接種7瓶，每瓶接種5株，30 d后對生根情況進行調查分析。

1.2.5 試管苗移栽。將葡萄試管苗從培養室移至室外，不需經過煉苗，直接將試管苗從三角瓶中取出，洗去根部附著的培養基，栽于基質中。移栽基質為細河砂、腐殖質土和蛭石。栽后適量澆水，覆以塑料薄膜，并做成拱棚形式。移栽后30 d調查試管苗的成活率等各項指標。

2 結果與分析

2.1 無菌植株的建立

取盆栽的紅富士、先鋒、黑奧林1年生枝條腋芽進行培養。由于腋芽帶菌量大，雖然用0.1%HgCl2消毒9 min，但難以徹底解決腋芽帶菌問題。接種3 d以后，陸續可見帶菌的腋芽，有的腋芽周圍有細菌菌落生長，有的腋芽周圍有真菌菌落生長，因此應及時將未染菌的腋芽轉移到無菌培養基上。有的腋芽雖未染菌，但已被組織內的氧化物氧化而褐化。接種后7 d，未被污染的腋芽均開始生長，表現為芽體膨大，少數可見葉片逐漸轉綠，葉片平展，即獲得無菌植株。3個品種腋芽生長情況的調查結果見表1。由表1可知，3個供試品種中，以黑奧林褐化率最低，僅28.33%，成苗率最高，為60.00%。培養30 d后，將無菌植株切成帶一個節的小段，在芽生長培養基中繼續培養，以擴大無菌苗數量。

2.2 叢生芽分化培養基的篩選

2.2.1 不同6-BA濃度對叢生芽分化效果的影響。在B5+NAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L培養基上，添加0.40、0.50、0.60 mg/L 6-BA，配制成3種培養基，接種3個供試品種無菌苗的帶節莖段，每處理接種6瓶，每瓶接種5個莖段。培養30 d后，對3個品種叢生芽的分化情況進行調查，結果見表2。由表2可知，當6-BA濃度為0.50 mg/L時，3個品種的平均叢芽數、平均芽高、每芽葉片數、單芽鮮重均高于其他2個濃度處理，濃度為0.60 mg/L時4項指標均為最低值。另外，3個品種間叢生芽分化效果存在差異，黑奧林的4項指標均高于先鋒和紅富士，而先鋒和紅富士間差異不明顯。

2.2.2 不同NAA濃度對叢生芽分化效果的影響。在B5+6-BA 050 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L基礎培養上添加010、0.15、0.20 mg/L NAA，配制成3種培養基，接種3個供試品種無菌苗，每處理接種6瓶，每瓶接種5苗。培養30 d后，對3個品種叢生芽的分化情況進行調查，結果見表3。由表3可知，當NAA濃度為0.10 mg/L時，先鋒的平均叢生芽數、平均芽高、每芽葉片數均優于其他2個濃度處理，叢芽生長快，葉片嫩綠，同時，在培養15 d后，有30%～40%小植株長出2～3條短而粗的白根。當NAA濃度為0.20 mg/L時，叢生芽發生少，且矮小皺縮，3個供試品種表現一致。

2.3 葡萄無菌苗生根培養基配方

以改良B5（微量元素和肌醇減半）為基礎培養基，分別添加蔗糖20 g/L、瓊脂6.5 g/L、活性炭0.3%和0.05、0.10、0.15 mg/L IAA，配制成3種不同培養基，接種3～4片真葉、生長基本一致的黑奧林無菌苗。接種后6 d幼苗基部膨大且有白色根尖突起，13 d后在3種生根培養基上的幼苗全部長出嫩根。由表4可知，當IAA濃度為0.10 mg/L時，幼苗生長良好，表現為苗高適度，平均每株根數達6.53條，根多而粗壯。因此，B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭0.3%可作為葡萄試管苗生根培養基。

2.4 葡萄試管苗移栽

3個供試品種的無菌苗在生根培養基上培養30 d，不需煉苗，可直接將試管苗從培養瓶中取出，用自來水洗去根部附著的培養基，移栽到細河砂、腐殖質土和蛭石中，用灑水壺適量澆水，再覆蓋塑料薄膜，做成拱棚形式。移栽后每天記錄試管苗植株生長情況，結果見表5。從移栽到長出新根天數看，以細河砂為基質發新根天數最短，3個品種的發根天數為11～16 d，其次為蛭石，發根天數為15～18 d，而在腐殖質土中的小植株很少發新根;第30天統計試管苗株高，3個品種生長在細河砂和蛭石中的苗高為9.13～11.33 cm和8.06～11.61 cm，而生長在腐殖質土中的苗高與移栽時的高度變化不大，為6.17～6.31 cm;第30天統計試管苗成活率，以細河砂和蛭石為基質的成活率較高，尤其是黑奧林在細河砂中移栽成活率達100%，植株根系發達，莖葉生長健壯。試管苗最適移栽氣溫為10～22 ℃，在試管苗移栽后，若塑料棚內溫度達到30 ℃以上，須開棚通風，以降低棚內溫度，避免高溫灼傷植株，傍晚溫度下降時，再將薄膜蓋嚴。待試管苗完全成活，可揭去塑料薄膜，讓試管苗在自然條件下生長。

3 結論與討論

以葡萄1年生枝條腋芽為外植體，以0.1%HgCl2消毒9 min為宜，3個供試品種的無菌苗獲得率為45.10%～6000%。以B5為基礎培養基，進行NAA、6-BA的單因素莖段培養試驗，篩選出了較優的叢生芽分化培養基配方，即 B5+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L，在該培養基上培養的3個葡萄品種的叢生芽分化率較高，平均叢生芽數在4.14芽/莖段。經試驗，試管苗生根培養基配方為改良B5+IAA 0.10 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭0.3%，在該培養基上培養的無菌苗13 d后全部長出嫩根，試管苗生根率達100%，幼苗根多且粗壯，莖葉生長旺盛。

以細河砂、腐殖質土、蛭石為基質移栽試管苗，并覆以塑料薄膜，以細河砂的移栽成活率最高，3個品種的幼苗成活率達86.67%～100%，其次為蛭石，試管苗成活率為71.67%～85.00%，而以腐殖質土為基質的試管苗成活率只有33.33%～43.33%，幼苗很少發新根。試管苗不需煉苗，可直接從培養瓶移栽到基質中，這與曾斌等[10]將已生根的瓶苗移出培養室，放置散射光較強處煉苗，使瓶苗在出瓶前充分進行光、濕、溫鍛煉的研究結果一致。移出3 d后擰松瓶蓋，5 d后將瓶蓋揭開，7 d后小心倒出瓶苗，用自來水沖洗，洗凈培養基，并直接移植到塑料小拱棚或溫室內的苗床上，這與潘春云等[11]先將葡萄試管苗煉苗7～11 d，再移栽到營養缽中有所不同。

參考文獻

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