差示苯酚-硫酸法結合DNS法測定紅芪多糖（HPS）含量

張小榮 黃鈺芳 何海 趙沙沙 郭玫 邵晶

摘要 [目的]優化建立差示苯酚-硫酸法結合DNS法測定紅芪多糖含量的方法。[方法]采用單因素試驗篩選考察差示苯酚-硫酸法的檢測波長、顯色劑用量、反應時間等條件;通過線性關系、精密度、穩定性、重復性、加樣回收率分別對差示苯酚-硫酸法和DNS法進行方法學考察。[結果]差示苯酚-硫酸法測得的紅芪樣品中以葡萄糖計的總糖含量平均值為72.49%，DNS法測得樣品中以葡萄糖計的還原性單糖含量平均值為8.13%，以葡萄糖計的多糖含量平均為64.36%，RSD均小于4%。[結論]該研究采用所建立的差示苯酚-硫酸法結合DNS法測定了紅芪多糖的含量，結果顯示此方法較準確穩定、重復性較好，在一定程度上減少游離還原糖及雜質的干擾，降低了由于操作等帶來的系統誤差，使樣品中多糖含量的測定結果更接近真實值，為紅芪多糖等中藥多糖的含量測定提供更好的參考方法。

關鍵詞 紅芪多糖;差示苯酚-硫酸法;DNS法;含量測定

中圖分類號 R 284文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）04-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.048

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Differential Phenol-Sulfuric Acid Method Combined with DNS Method to Determine the Content of Hedysarum Polysaccharides （HPS）

ZHANG Xiao-rong1，2，HUANG Yu-fang1，2，3， HE Hai1，2 et al （1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000;2. Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000;3.Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000）

Abstract [Objective]To optimize the establishment of a differential phenol-sulfuric acid method combined with DNS method for the determination of HPS content. [Method]Single factor experiment was used to screen and investigate the detection wavelength， developer dosage， reaction time and other conditions of the differential phenol-sulfuric acid method; the differential phenol was determined by linear relationship， precision， stability， repeatability and sample recovery. Sulfuric acid method and DNS method for methodological investigation. [Result]The average total sugar content in the Hedysari radix sample measured by the differential phenol-sulfuric acid method was 72.49%， and the average reduction monosaccharide content in the sample measured by the DNS method was 8.13%， which was calculated as the glucose. The average content of polysaccharides was 64.36%， and the RSD was less than 4%. [Conclusion]The study uses the established differential phenol-sulfuric acid method combined with the DNS method to determine the HPS content. The results show that this method is more accurate， stable and has good repeatability. It reduces the interference of free reducing sugars and impurities to a certain extent， and reduces the system error caused by operation， etc.， makes the determination result of polysaccharide content in the sample closer to the true value， which will provide a better reference method for the determination of polysaccharide content in traditional Chinese medicine such as HPS.

Key words Hedysari polysaccharides （HPS）;Differential phenol-sulfuric acid method;DNS method;Content determination

基金項目 蘭州市城關區科技計劃項目（2020-2-2-2）;甘肅省科技廳自然科學基金項目（17JR5RA163）;甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心開放課題（ZYGY202004）;中醫藥公共衛生服務補助專項子課題（2305191901）;甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金項目（ZDSYS-KJ-2018-005）。

作者簡介 張小榮（1992—），女，甘肅慶陽人，碩士研究生，研究方向：中藥藥效物質基礎與質量標準。*通信作者，博士，教授，碩士生導師，從事中藥活性物質基礎與質量控制研究。

收稿日期 2021-05-11

中藥多糖作為天然產物，近年來在疾病預防及保健品開發方面有廣闊的應用前景。但多糖分子量大、組成和結構復雜，且多糖的活性往往是由混合總糖共同作用的結果，又由于生長環境、制備工藝等不同，使中藥多糖這一混合物不具備單體化合物那樣準確的評價標準，其含量測定的方法和準確性也一直是個難題。

對于總糖的含量測定，現大多還是采用苯酚-硫酸[1-3]、蒽酮-硫酸、3，5-二硝基水楊酸（DNS）等傳統比色法，其中最常用的是Dubois等[4-5]在1951年提出的苯酚-硫酸法，其操作簡便、應用廣泛。但傳統苯酚-硫酸法不能排除樣品中可直接與硫酸顯色的非多糖雜質及還原性單糖的干擾，且反應溫度、時間、試劑等條件對測定結果的穩定準確有影響。而賀福元等[6]提出的差示苯酚-硫酸法將苯酚和H2SO4先配制成顯色液，以樣品與顯色液反應測定的吸光度與樣品和濃硫酸反應完全冷卻再加苯酚測定的吸光度的差值進行計算，在一定程度上減少了雜質干擾及系統誤差，且避免了顯色過程中由H2SO4放熱反應而導致的誤差;而DNS法可直接測定還原性單糖含量。

紅芪是豆科植物多序巖黃芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz）的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血的功效[7]，其主要活性部位紅芪多糖（hedysari polysaccharide，HPS）具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病等藥理作用[8-9]。該研究結合差示苯酚-硫酸法和DNS法的特點，建立了測定紅芪多糖的方法[10]，以期為紅芪多糖等中藥多糖的含量測定提供更好的參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 紫外分光光度儀（UV-3300型，上海美譜達儀器有限公司）;1/10000電子分析天平（AL104型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;超聲儀（SB-5200DTD型，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 紅芪原料藥材購自甘肅省隴南市瑞達中藥材專業合作社，產地甘肅省隴南市武都區柏林鎮鄉樓兒下村，經甘肅中醫藥大學晉玲教授鑒定，系豆科植物多序巖黃芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz）的干燥根;紅芪多糖（HPS），前期篩選優化的提取純化工藝制得;D-無水葡萄糖標準品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%，批號B21882）;蒸餾水;苯酚、硫酸、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉等其他試劑均為國產化學純。

1.3 方法

1.3.1 差示苯酚-硫酸法測定總糖含量的方法建立[11-13]。

1.3.1.1 對照品溶液的制備。以蒸餾水配制濃度為0.428 mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備。樣品粉末10 mg以蒸餾水40 ℃超聲20 min使其溶解，定容于25 mL容量瓶。

1.3.1.3 試液的制備。①顯色劑的配制。將50 mL濃硫酸緩緩加入10 mL蒸餾水中，冷至室溫后加苯酚0.6 g，攪拌溶解，低溫保存，6 h內使用。②50 g/L苯酚溶液的配制。精密稱取苯酚晶體5 g于棕色瓶，加100 mL蒸餾水溶解即得（該試液需新鮮配制，低溫保存，6 h內使用）。③83.3%硫酸溶液的配制。精密量取50 mL濃硫酸加入10 mL蒸餾水中，搖勻，即得。

1.3.1.4 檢測波長的選擇。精密量取對照品溶液、樣品溶液各1.0 mL分別置具塞試管，加蒸餾水補至2.0 mL，加顯色劑5.0 mL，沸水浴反應30 min，取出，迅速冷至室溫，精密加蒸餾水1.0 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在400～800 nm掃描，得A1圖。另精密量取對照品溶液、樣品溶液各1.0 mL分別置具塞試管，加83.3%H2SO4溶液5.0 mL，沸水浴反應30 min，迅速冷至室溫，精密加50 g/L苯酚溶液1.0 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在400～800 nm掃描，得A2圖。

1.3.1.5 顯色條件的考察。

（1）顯色劑用量的考察。精密量取多糖樣品溶液7份于具塞試管中，0.6 mL/份，加蒸餾水補至2.0 mL，分別依次加入顯色劑1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，沸水浴加熱反應30 min，取出，迅速冷卻至室溫，精密加入蒸餾水1.0 mL，搖勻。以相應試劑為空白，按照分光光度法在“1.3.1.4”項下確定的檢測波長處測定吸光度。

（2）反應時間的考察。精密量取多糖樣品溶液7份于具塞試管中，0.6 mL/份，加蒸餾水補至2.0 mL，分別精密加入顯色劑5.0 mL，置于沸水浴中，分別依次加熱10、15、20、25、30、35、40 min，取出，迅速冷卻至室溫，精密加入蒸餾水1.0 mL，搖勻。以相應試劑為空白，按照分光光度法在“1.3.1.4”項下確定的檢測波長處測定吸光度。

1.3.1.6 方法學考察。

（1）線性關系考察。精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加蒸餾水補至2.0 mL，加顯色劑5.0 mL，沸水浴反應30 min，取出，速冷至室溫，精密加蒸餾水1.0 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在“1.3.1.4”項下確定的檢測波長處測定吸光度A1。另精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中，分別加蒸餾水補至2.0 mL，精密加入83.3%H2SO4溶液5.0 mL，沸水浴反應30 min，取出，速冷至室溫，精密加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在“1.3.1.4”項下確定的檢測波長處測定吸光度A2，分別計算得ΔA（ΔA=A1-A2）。以葡萄糖質量濃度為橫坐標、ΔA為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。

（2）精密度試驗。取同一樣品溶液，按“1.3.1.6”線性關系考察中的方法連續測定6次，分別得A1、A2，計算ΔA、RSD值。

（3）穩定性試驗。取同一樣品溶液，按“1.3.1.6”線性關系考察中的方法在0、10、20、30、40、60 min測定A1和A2值，并計算ΔA和RSD值。

（4）重復性試驗。取同一多糖樣品5份，按“1.3.1.6”線性關系考察中的方法測定A1和A2值，并計算ΔA和RSD值。

（5）加樣回收率試驗。分別精密稱取對照品2.36、2.95、3.54 g各3份，加至樣品中，按“1.3.1.6”線性關系考察中的方法測定，并計算含量及加樣回收率。

1.3.1.7 樣品測定。精密量取各供試品溶液1 mL分別置具塞試管中，按“1.3.1.6”線性關系考察中的方法測定A1、A2，計算ΔA，代入線性方程計算樣品溶液的質量濃度C（mg/mL），并按下式計算樣品中總糖含量：多糖含量=（C×D）/W×100%，式中，D為稀釋倍數，W為樣品質量（mg）。

1.3.2 DNS法測定還原性單糖含量的方法建立[14-17]。

1.3.2.1 對照品溶液的制備。以蒸餾水配制濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備。樣品粉末100 mg以蒸餾水40 ℃超聲20 min使其溶解，定容于25 mL容量瓶。

1.3.2.3 DNS顯色試劑的配制。3，5-二硝基水楊酸3.15 g、NaOH 10.5 g，充分溶解于250 mL蒸餾水中（水先煮沸10 min后冷卻）;再加四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.5 g（50 ℃水中融化）、2.5 g無水Na2SO3，攪拌使溶解，定容至500 mL，避光低溫放置7～10 d后使用。

1.3.2.4 方法學考察。

（1）標準曲線的繪制。精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置干燥具塞試管，加蒸餾水補至6 mL，分別精密加入DNS試液2 mL，混勻，置沸水浴反應5 min，取出，立即冷卻至室溫，以蒸餾水補至8 mL，搖勻。以相應試劑為空白，在500 nm處測定吸光度A，繪制標準曲線。

（2）精密度試驗。取同一樣品溶液，按“1.3.2.4”標準曲線繪制項下方法連續測定6次，計算RSD值。

（3）穩定性試驗。取同一樣品溶液，分別于0、10、20、30、40、60 min按“1.3.2.4”標準曲線繪制項下方法測定吸光度，計算RSD值。

（4）重復性試驗。取同一樣品5份，按“1.3.2.4”標準曲線繪制項下方法測定吸光度，計算RSD值。

（5）加樣回收率試驗。取同一樣品9份，分別精密稱取對照品2.24、2.80、3.36 g各3份，加至樣品中，按“1.3.2.4”標準曲線繪制項下方法測定，計算RSD值。

1.3.2.5 樣品測定。精密量取各供試品溶液1 mL，按照“1.3.2.4”標準曲線繪制項下方法測定、計算，即得供試品中以葡萄糖計的還原性單糖濃度C（mg/mL），按下式計算樣品中還原性單糖含量：還原性單糖含量=（C×D）/W×100%，式中，D為稀釋倍數，W為樣品質量（mg）。

1.3.3 樣品中多糖含量的計算。按“1.3.1”差示苯酚-硫酸法測得5批樣品中以葡萄糖計的總糖含量，以及按“1.3.2”DNS法測得各樣品以葡萄糖計的還原性糖含量，即可得各樣品中以葡萄糖計的多糖含量。

2 結果與分析

2.1 差示苯酚-硫酸法測定總糖含量

2.1.1 檢測波長的選擇。由差示苯酚-硫酸法全波長掃描圖（圖1）可見，對照品與樣品的A1、A2掃描圖均在490 nm處有吸收，且對照品與樣品的A1圖在490 nm處的吸收明顯強于A2圖，因此，選擇490 nm作為測定波長。

2.1.2 顯色條件的考察。

（1）顯色劑用量的考察。從圖2可以看出，隨著顯色劑用量的增加，吸光度逐漸增加，5.0 mL時吸光度最大。因此，確定顯色劑最佳用量5.0 mL。

（2）反應時間的考察。從圖3可以看出，水浴加熱30 min 時，吸光度最大，說明多糖已完全水解并反應，因此，選擇30 min為最佳反應時間。

2.1.3 方法學考察。

（1）線性關系考察。按照“1.3.1.6”中方法操作，以葡萄糖質量濃度為橫坐標、ΔA為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得線性回歸方程ΔA=0.002C+0.054（r=0.993 0），表明葡萄糖質量濃度在42.8～428.0 μg/mL線性關系良好。

（2）精密度試驗。按照“1.3.1.6”中方法操作，連續測定6次，分別得A1、A2，計算ΔA，RSD為0.32%，表明儀器精密度良好。

（3）穩定性試驗。按照“1.3.1.6”中方法操作，在0、10、20、30、40、60 min分別測定A1和A2值，并計算ΔA，RSD為1.37%，表明以差示苯酚-硫酸法顯色后的樣品溶液在1.0 h內穩定性良好。

（4）重復性試驗。按照“1.3.1.6”中方法操作，計算得RSD為1.65%，表明重復性良好。

（5）加樣回收率試驗。按照“1.3.1.6”中方法操作，由表1可見，總糖的平均回收率為96.14%，RSD為2.35%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.2 DNS法測定還原性單糖含量

2.2.1 標準曲線的繪制。按照“1.3.2.4”中方法操作，以相應試劑為空白，在500 nm處測定吸光度A，得出標準曲線的方程為A=12.84C+0.030 1（r=0.997 1），結果表明葡萄糖濃度在0.2～1.2 mg/mL與吸光度線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗。按照“1.3.2.4”中方法操作，連續測定6次，RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗。按照“1.3.2.4”中方法操作，分別于0、10、20、30、40、60 min測定，RSD為2.01%，表明以DNS法顯色后的樣品溶液在1 h內穩定。

2.2.4 重復性試驗。按照“1.3.2.4”中方法操作，測得RSD為1.97%，表明DNS法檢測樣品中還原性單糖的重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗。按照“1.3.2.4”中方法操作，由表2可見，還原性單糖的平均回收率為97.36%，RSD為1.34%，表明DNS法測定還原性單糖的準確度較好。

2.3 樣品中多糖含量的計算 從表3可以看出，差示苯酚-硫酸法測得的紅芪樣品中以葡萄糖計的總糖含量在68.26%～75.83%，平均值為72.49%;DNS法測得樣品中以葡萄糖計的還原性單糖含量在7.36%～9.05%，平均值為8.13%;以葡萄糖計的多糖含量在60.90%～67.14%，平均為64.36%;RSD均小于4%。

3 結論

該研究結合差示苯酚-硫酸法和DNS法2種方法的特點，建立了差示苯酚-硫酸法結合DNS法測定紅芪多糖含量的方法。結果顯示，對通過篩選優化的提取純化工藝制得的5個批次紅芪多糖樣品各平行檢測3份，差示苯酚-硫酸法測得的紅芪樣品中以葡萄糖計的總糖含量平均為72.49%，DNS法測得樣品中以葡萄糖計的還原性單糖含量平均為8.13%，以葡萄糖計的多糖含量平均為64.36%;RSD均小于4%。該研究所建立的差示苯酚-硫酸法結合DNS法測定多糖含量的方法較準確穩定、重復性較好，在一定程度上減少了雜質干擾及系統誤差，以差示苯酚-硫酸法測得的總糖含量減去DNS法測得的還原性單糖含量，使樣品中多糖含量的測定結果更接近真實值，為紅芪多糖的進一步研究提供了數據支撐，也為中藥多糖的含量測定提供了參考方法。

參考文獻

[1]

王法琴，陸兔林，毛春芹，等.3種比色法測定五味子中多糖[J].中成藥，2015，37（4）：814-818.

[2] 文喜艷，邵晶，王蘭霞，等. 正交設計結合3種比色法優選黃芪多糖提取工藝[J] .中華中醫藥雜志，2018，33（4）：1562-1566.

[3]張聰，樊麗博，楊會鮮，等.五加芪粉中總糖的含量測定[J].安徽農業科學，2018，46（33）：147-148，160.

[4] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.A colorimetric metllod for the determination of sugars[J].Nature，1951，168（4265）：167.

[5] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem，1956，28（3）：350-356.

[6] 賀福元，羅杰英，劉平安，等.差式酚硫法的建立及對五子衍宗顆粒劑中多糖測定比較研究[J].中醫藥導報，2006，12（1）：2-5.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2020年版一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2020：159.

[8] 雷文暉，李潔.紅芪多糖的藥理作用研究進展[J].實用藥物與臨床，2019，22（9）：976-979.

[9] 趙昱波，陳俊，許浚，等.紅芪的化學成分及抗腫瘤作用研究進展[J].中草藥，2015，46（22）：3434-3440.

[10] 毛淑敏，許家珍，周帥飛，等. 苯酚-硫酸法聯合DNS法測定金銀花不同花期多糖的含量[J].中南藥學，2015，13（1）：65-67.

[11] 魏舒暢，王繼龍，李昶，等.改良差示酚硫法測定紅芪粗多糖的方法研究[J].中成藥，2013，35（3）：634-636.

[12] 陳暉，閆治攀，陳方圓，等.改進差示苯酚-硫酸法測定維血寧顆粒多糖含量[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21（3）：84-86.

[13] 王薇薇，張曜武，龍堂榮，等.改良差示酚硫法測定紅松松塔多糖的含量[J].西北藥學雜志，2013，28（4）：340-342.

[14] 彥繁鶴，周金梅，吳如春. DNS法測定甘蔗渣中還原糖含量[J].食品研究與開發，2015，36（2）：126-128.

[15] 王俊麗，聶國興，李素貞，等. DNS法測定還原糖含量時最適波長的確定[J].河南農業科學，2010，39（4）：115-118.

[16] 江建麗. 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定五味子還原糖含量的適宜條件[J].海峽藥學，2014，26（1）：57-60.

[17] 鄺潔容，陳伯叢，梁曉燕. DNS法測定木瓜中多糖的含量及不同炮制品的比較[J].北方藥學，2019，16（7）：1-3.

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