高羊茅FeTOC1基因的克隆、差異表達及亞細胞定位分析

王 茜 吳佳海 陳 瑩 王小利,*

(1 貴州省農業科學院草業研究所，貴州 貴陽 550006；2 貴州省農業科學院果樹研究所，貴州 貴陽 550006)

開花是植物由營養生長向生殖生長轉變的關鍵過程，在植物生長發育過程中發揮著至關重要的作用[1-2]。針對模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究發現，存在5條遺傳調控途徑，其能夠通過整合內外部的信號，最終調節擬南芥的成花轉變，其中，光周期途徑作為該五大重要途徑之一而備受關注[3-5]。在光周期途徑中，植物通過感受光照刺激產生規律的自我調節，被稱為生物鐘。生物鐘在調控真核生物生理過程方面發揮著至關重要的作用[6]。此外，生物鐘還可以作為真核生物內在的時間調節器，指導有機體不斷地自我調節，以達到最終適應外界環境變化的目的[7-8]。大多數有機體都有保守的產生生物鐘節律的機制，即由中央振蕩器產生的基于轉錄水平的負反饋調節作用[9]。已有研究結果表明，MYB類蛋白基因LHY(late elongated hypocotyll)和CCA1 (circadian clock assoiated1)，以及偽反應調節因子TOC1 (timing of CAB expression 1)三者構成了中央振蕩器的核心組分[10-11]。

TOC1和LHY/CCA1之間的反饋調節構成了擬南芥生物鐘中央振蕩器的基本框架[12]。CCA1和LHY的mRNA表達水平通常在清晨達到高峰，其編碼的蛋白結合在TOC1啟動子的夜晚元件上發揮負調控作用，使得TOC1的轉錄水平下調; 下調后的TOC1編碼的蛋白正向調控CCA1和LHY的表達水平，致使CCA1和LHY的表達水平隨之下調，最終在接近黃昏時，CCA1和LHY的表達再次通過負反饋調節，使TOC1的mRNA和其編碼的蛋白水平均達到峰值[12-14]。其中TOC1主要負責穩定中央振蕩器的調節作用，Huang等[15]研究發現，中央振蕩器的性能在擬南芥TOC1超表達和突變體中均發生了極大的變化。TOC1作為APRRs家族(Arabidopsispseudo-response regulators)的重要成員，又名APRR1或PRR1，該家族還包括APRR3、APRR5、APRR7和APRR9等4個成員[16]。Matsushika等[10]研究指出，擬南芥中5個APRR基因呈現晝夜規律和時間表達順序模式，APRR9首先在黎明時開始表達，隨著時間的推移，APRR7、APRR5、APRR3依次相繼表達，直到夜間TOC1表達；Makino等[17]研究發現，持續光照條件下，APRR9、APRR7、APRR5和APRR3均因TOC1的超量表達而不同程度地失去了節律性表達模式; Sato等[18]發現過量表達APRR5，致使APRR9和APRR7的表達水平急劇下降，APRR3和TOC1的表達水平則上調并達到峰值。Farré等[19]研究發現，CCA1通過結合APRR7和APRR9基因啟動子的CBS (CCA1-binding site)結構域調控上述基因的表達。由此可見，APRRs家族成員的轉錄和翻譯水平均表現出晝夜節律變化，并在中央振蕩器中發揮一定的作用。此外，從APRR9到TOC1的這種調控提供了一種可變的輸出機制，導致從黎明到傍晚的任何時刻，都可以對相關基因進行調控，最終調節TOC1的表達水平[20]。

在大多數植物體內光周期基因都是相對保守的，然而隨著進化的推移及生活環境的不斷變化，植物體內基因(甚至是同源基因)的生物學功能會表現出不同程度的差異性[20]。雖然TOC1已被公認為是重要的開花調控轉錄因子，但其在生物鐘維持方面的具體作用仍存在眾多爭議，且目前針對其功能的研究主要集中于雙子葉植物，特別是模式植物擬南芥[21-22]。高羊茅(Festucaelata)作為單子葉植物，其發育性狀與雙子葉植物存在很大差異。高羊茅是一種重要的冷季型牧草及草坪草，具有很強的抗逆性，被廣泛應用于水土保持、運動場建植、城市綠化和環境保護等方面，已成為我國使用量增長最快的草種。然而，目前我國高羊茅草坪草品種基本依賴于歐美進口，亟待選育適應我國氣候環境，特別是適應南方典型短日照地區(如貴州省)條件的新品種?；诖?，本研究克隆獲得高羊茅TOC1基因的cDNA全長，將其命名為高羊茅FeTOC1，并對其進行生物信息學分析；隨后，利用熒光蛋白對FeTOC1進行亞細胞定位；最后，利用實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)對高羊茅葉片中FeTOC1在3種不同光周期模式下(長/短日照、連續光照/黑暗和晝夜顛倒)的表達水平進行分析，旨在從分子調控層面揭示FeTOC1在維持高羊茅生物鐘方面發揮的作用，為培育適應短日照地區牧草新品種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)獵狗五號(百綠草種公司，貴陽)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養 挑選籽粒飽滿的高羊茅獵狗五號種子播種于泥炭土和蛭石混合(1∶1)基質中，置于光照培養箱中培養。澆灌Hoagland營養液，每4 d更換一次。培養箱晝/夜溫度為(22±2℃)/(20±2℃)，光強約230～300 μmol·m-2·s-1，相對空氣濕度為60%～70%。

1.2.2 材料處理與取樣 將高羊茅進行以下3種不同光周期模式處理(表1)。處理結束后，每4 h收集各處理下高羊茅葉片于液氮中速凍，連續取樣48 h，保存于-80℃冰箱中，用于檢測FeTOC1基因在不同光周期模式下的表達水平。

表1 不同光周期模式處理Table 1 Treatments of diverse photoperiod patterns

1.2.3 高羊茅FeTOC1基因全長的cDNA克隆 選擇NCBI網站上已公布的其他植物TOC1核苷酸序列進行同源性比對，根據同源性高簡并性低的原則，使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設計引物用于擴增高羊茅TOC1基因片段，再結合3′和5′ RACE試劑盒(Inivtrogen，美國)的引物進行套式PCR擴增 (引物見表2)。

表2 高羊茅FeTOC1基因克隆及qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for cloning and qRT-PCR amplification of FeTOC1

參照TRIZOLTMKit(上海生工)RNA法提取高羊茅葉片RNA，詳細流程參見文獻[23]。使用Fermentas公司(加拿大)的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。利用設計的簡并性引物TOC1F2和TOC1F2進行目的片段的PCR擴增：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個循環；72℃終延伸10 min，保存于4℃冰箱中。目的片段按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明進行回收和純化，再將篩選獲得的陽性克隆進行測序(寶生物工程，大連)。該結果經比對確定為TOC1基因后，采用RACE技術獲得TOC1基因的5′和3′端。將克隆獲得的中間片段、5′RACE和3′RACE結果在DNAMAN軟件中進行拼接，最終獲得高羊茅TOC1基因的全長cDNA序列。

1.2.4 生物信息學分析FeTOC1的BLAST搜索在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 網站上完成；等電點、分子質量及穩定系數分析在ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html)網站上完成；使用MEGA 5.0軟件構建FeTOC1的系統進化樹，并對其氨基酸序的同源性進行分析。

1.2.5 亞細胞定位 將目的蛋白與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合表達載體進行轉化，選擇陽性轉化的農桿菌GV3101菌液注射入本氏煙草(Nicotianaattenuata)葉片，其中空載體為對照，共同在黑暗條件下培養48 h，隨后在共聚焦顯微鏡下檢測熒光信號。

1.2.6 不同光周期處理下高羊茅FeTOC1基因表達模式分析 按照1.2.3的方法獲得cDNA，并稀釋20倍作為qRT-PCR的模板。使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設計特異性表達引物，用于擴增高羊茅FeTOC1基因片段，GAPDH作為內參基因(引物見表2)，反應條件同1.2.3。每個樣品3個生物學重復，每個生物重復3個技術重復。采用2-ΔΔCt法[24]計算FeTOC1基因在各處理下的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 高羊茅FeTOC1基因全長cDNA序列分析

將引物TOC1F2和TOC1R2擴增獲得的核心片段、5′ RACE和3′ RACE結果在DNAMAN軟件中進行拼接，最終獲得高羊茅FeTOC1基因的全長cDNA序列為1 557 bp，編碼517個氨基酸(圖1、2)。在NCBI上進行BLAST搜索，比較結果顯示該基因與小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、山羊草(Aegilopstauschii)等禾本科單子葉植物的TOC1基因具有較高的同源性，同源性程度依次為99%、94%、99%、99%，與擬南芥、玉米(Zeamays)、馬甲竹(Bambusatulda)、高粱(Sorghumbicolor)等雙子葉植物的TOC1基因亦具有較高的同源性，均為93%以上。

圖1 半定量RT-PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative reverse transcription-PCR products

圖2 高羊茅FeTOC1核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of FeTOC1 from Festuca elata

2.2 高羊茅FeTOC1基因生物信息學分析

將獲得的FeTOC1基因全序列通過在線軟件ProtParam進行預測，FeTOC1基因編碼517個氨基酸，其分子式為C2506H3921N729O794S24，分子質量為57.735 55 kDa。 編碼的蛋白質等電點為6.12，親水性為-0.635，不穩定系數為46.55。隨后，將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與山羊草、小麥、大麥、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)和擬南芥氨基酸序列進行多重比對，結果顯示，與其他植物同源基因一致，保守區PR (peudoreceiver domain)和CCT結構域[CONSTANS (CO), CO-like, TOC1]分別位于高羊茅FeTOC1氨基酸序列的N、C兩端，并且C端呈酸性(圖3)。

注：紅色和綠色下劃線區域分別代表保守區PR和CCT結構域。Note: The red and green underlined regions represent the conserved PR and CCT domains, respectively.圖3 高羊茅FeTOC1與其他植物TOC1的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of FeTOC1 from Festuca elata with others from hight plants

2.3 高羊茅FeTOC1系統進化樹分析

利用Mega 5.0軟件制作21種植物TOC1蛋白質序列的系統進化樹，結果如圖4所示。相比雙子葉植物擬南芥、煙草、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等，高羊茅FeTOC1蛋白質與禾本科植物更為相近，其中與大麥、小麥及粗山羊草親緣關系最近，均達到99%。

圖4 高羊茅FeTOC1蛋白質序列與其他植物TOC1蛋白質序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of FeTOC1 from Festuca elata and those from other plants

2.4 高羊茅FeTOC1的亞細胞定位分析

構建目的蛋白與GFP融合表達載體，結果如圖5所示。從左到右依次為目的基因/空載體的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、葉綠體自發熒光(chloroplast auto-fluorescence, CHI)、明場(bright field, DIC)和三通道疊加場(Merge)。對照組在細胞核、細胞質和細胞膜均檢測到熒光信號，試驗組僅在細胞核中檢測到熒光信號。經亞細胞定位分析可知，FeTOC1位于細胞核。

圖5 高羊茅FeTOC1的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of FeTOC1

2.5 高羊茅FeTOC1基因在不同光周期下表達模式分析

2.5.1FeTOC1基因在長日照和短日照條件下的晝夜表達模式分析 長日照條件下，FeTOC1基因表達展現出規則的晝夜振蕩節律，且周期為24 h。第一個光周期內，FeTOC1基因表達的水平從光照處理時間(zetgeber time, ZT)凌晨4點后開始急劇增加，于中午12點達到峰值，隨后其表達水平急劇下降；第二個光周期內，FeTOC1基因表達水平呈現同樣的變化趨勢，但其表達峰值提前了4 h，出現于早晨8點(圖6-A)。短日照條件下，FeTOC1基因表達的模式與長日照下相同(圖6-B)。由此表明，FeTOC1基因的表達水平受光周期的調控，與生物鐘控制的晝夜節律相關，但日照長短對該基因表達模式并無明顯影響。

注：橫坐標下黑色條形代表黑暗處理；白色條形代表光照處理。下同。Note: The black bar on the horizontal axis represents the dark treatment. The white bars represent light treatment. The same as following.圖6 高羊茅葉片FeTOC1基因在長日照(A)和短日照(B)下的表達Fig.6 FeTOC1 gene expression level under long-(A) and short-days (B) in Festuca elata leaves

2.5.2FeTOC1基因在連續光照和連續黑暗條件下表達模式分析 長日照培養3周后，連續光照1周，FeTOC1基因表達水平在48 h內呈現較弱的振蕩趨勢，但其在統計學上無顯著差異(P< 0.05) (圖7-A)；而連續黑暗1周后，其表達水平呈現規則的震蕩節律且周期為24 h，FeTOC1基因表達峰值分別出現于第一個光周期的凌晨4點和第二個光周期的凌晨0點，相比于第一個光周期，第二個光周期的峰值提前了4 h (圖7-B)。短日照培養3周后，連續光照1周，FeTOC1基因表達水平呈現先上升后下降的振蕩規律，變化周期為24 h，其表達峰值分別出現于第一個光周期的中午2點和第二個光周期的早晨8點，同樣，第二個光周期的峰值比第一個光周期提前了4 h (圖7-C)；連續黑暗1周后，FeTOC1基因表達模式與連續光照相似，峰值分別出現于ZT4和ZT8，相比于第一個光周期，第二個光周期的峰值滯后了4 h (圖7-D)。綜上可知，外界光照條件的變化直接影響FeTOC1基因的表達水平。植株在接受連續光照或連續黑暗的處理后，FeTOC1基因的表達模式與正常光照處理一致，表現出一定的晝夜振蕩節律，其周期為24 h?？梢奆eTOC1基因在適應外界環境變化時，其表達水平受到一定程度的影響，但能夠保持一定的穩定節律，以保障植物正常開花生長。值得注意的是，相比于其他日照處理，長日照后持續光照極大地削弱了FeTOC1基因的振蕩節律，說明該基因的表達對黑暗的積累有一定程度的依賴。

圖7 高羊茅葉片FeTOC1基因在長日照(A和B)和短日照(C和D)后連續光照(A和C)和連續黑暗(B和D)下的表達Fig.7 FeTOC1 gene expression level under continual illumination (A and C) and continual darkness (B and D) in Festuca elata leaves after long-(A and B) and short-days (C and D)

2.5.3FeTOC1基因在晝夜顛倒下的表達模式分析 圖8-A為試驗對照組，即植株自播種之日起，遵循外界晝夜規律長日照4周。長日照培養3周后，晝夜顛倒處理1周，FeTOC1基因表達水平呈現規則的振蕩節律，且周期為24 h，其表達峰值均出現在ZT0，且與對照組相比，其表達模式呈現相反的變化趨勢(圖8-B)。植株自播種之日起，顛倒晝夜培養4周后，FeTOC1基因表達水平依然呈現規則的振蕩節律且周期為24 h，其表達峰值均出現在ZT20，同樣與對照組相比，表達模式相反(圖8-C)。顛倒晝夜培養3周后，遵循外界晝夜規律長日照1周，FeTOC1基因表達模式與對照組一致(圖8-D)。由此可見，FeTOC1基因表達水平隨著外界環境晝夜節律的變化表現出規律的晝夜振蕩周期，且其周期為24 h。

圖8 高羊茅葉片FeTOC1基因在晝夜顛倒下的表達Fig.8 FeTOC1 gene expression level under day and night inversion in Festuca elata leaves

3 討論

自TOC1首次從擬南芥中分離獲得以來，其在植物生物鐘調節中的重要地位備受關注[12-13, 25]。TOC1屬于擬南芥APRR基因家族，與其他成員結構類似，其編碼的蛋白質N端存在大約120個氨基酸組成的非典型PR結構域，C端則存在大約50個氨基酸構成的CCT結構域，但與其他成員不同的是TOC1不存在IR區域(intermediate region)[26-27]。本研究將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與其他植物TOC1氨基酸序列進行多重比對發現，它們具有高度的相似性，在PR結構域中心的周圍，均含有一個獨特的谷氨酸殘基(E) (圖3)，這是偽接收器的標志性特征之一，真正的接受器在同樣的位置包含的是接受磷酸的天冬氨酸殘基(D)[28]。預測的高羊茅CCT結構域的氨基酸序列經比對，與禾本科山羊草、大麥、小麥及二穗短柄草的CCT結構域的氨基酸序列具有高度一致性(圖3)。進一步通過系統進化樹分析發現，高羊茅FeTOC1蛋白質與禾本科大麥、小麥及粗山羊草TOC1蛋白質親緣關系最近(圖4)。TOC1基因通常編碼含有非典型接受結構域的定位于細胞核的蛋白[25, 29]。本研究亞細胞定位結果顯示，FeTOC1表達的蛋白定位在細胞核中(圖5)，表明TOC1可能參與功能重要的復合物合成，如轉錄體、剪接體或蛋白體[30]。

生物鐘通過整合外界環境和植物內部信號調節植物體內的各種生理活動[31-32]。其中中央振蕩器通過輸入光信號產生節律，隨后向下游通路進行傳遞，使其識別晝夜信號，由此可知中央振蕩器是生物鐘不可或缺的組分[29]。Alabadí等[12]發現，TOC1在維持生物鐘穩定調控中發揮至關重要的作用。針對TOC1基因在植物不同組織中表達豐度的研究發現，在單子葉植物小麥中，以15 d小麥的莖尖、幼根、幼葉和90 d小麥的節、莖、葉鞘、老根、老葉、幼穗為測定對象，其中幼根、幼葉和老葉中TOC1的表達豐度最高，且其表達水平相當[32]；在雙子葉植物玉米中，以花粉、雄蕊、穗軸、穗位葉、氣生根、莖、花絲、胚芽鞘、胚根、根和苞葉為測定對象，其中從胚根和穗位葉提取的TOC1表達豐度最高[29]。基于此，本研究在高羊茅葉片中檢測TOC1基因的表達水平，結果表明在長日照(16L/8D)、短日照(8L/16D) 條件下，其表達均表現出一定的晝夜節律性(圖6)，與擬南芥TOC1、小麥TaTOC1和水稻OsTOC1的表達特性基本相似[25,33-35]。FeTOC1基因在長日照(圖6-A)和短日照(圖6-B)下表達量的高峰均在第一個振蕩周期出現在光照后4 h (中午12點ZT12)，第二個振蕩周期出現在開始給予光照(早晨8點ZT8)，這兩個點在長短日照的晝夜交替變化中都處于黎明時分，可見高羊茅FeTOC1基因的表達相位不受日照長度變化的影響，同時它還保持了晚間積累性表達的特點。

生物鐘基因通常在沒有晝夜交替信號的刺激下，仍然能通過自身內在的生物鐘節律維持一定時間的規律性表達[7-8]。本研究分別將長短日照培養3周的高羊茅轉移至持續光照或持續黑暗條件下適應1周，FeTOC1基因的表達仍然具有不同程度的節律性，但是基因表達的整體水平與長短日照條件下相比，有明顯的削弱趨勢(圖7)，說明FeTOC1基因的表達強烈依賴外界晝夜交替的信號刺激。值得注意的是，FeTOC1基因在高羊茅長日照培養后移至持續光照48 h環境，雖然呈現出一定的振蕩節律，但其在統計學上差異不顯著(圖7-A)，這與小麥TaTOC1和水稻OsTOC1持續黑暗條件下的表現類似[33-35]。暗示即便同為單子葉植物，高羊茅FeTOC1基因表達的調控對于光照的需求弱于小麥和水稻。如圖7-B、D所示，無論長或短日照培養，持續黑暗48 h，FeTOC1基因依然維持其表達水平和晝夜節律性，這與擬南芥TOC1基因相似[24]。由此進一步說明黑暗可能是啟動并維持高羊茅FeTOC1基因節律性表達的重要因素。

Strayer等[25]研究擬南芥toc1-1突變體發現，TOC1功能的缺失導致植物體內在的生物鐘節律縮短，從正常的24 h變為21 h?；诖?，本研究分析晝夜顛倒后FeTOC1的表達模式，以期了解TOC1如何響應外界晝夜交替的信號刺激，結果顯示，無論是遵循外界晝夜規律，還是顛倒外界晝夜規律，FeTOC1基因的表達均表現出明顯的節律性振蕩，其振蕩周期為24 h；同時，FeTOC1基因的表達均在黑暗時開始積累，并在給予光照0～4 h后達到峰值(圖8)。由此可見，相比于遵循植物體內穩定的內在生物鐘節律，FeTOC1基因的表達首先受外界晝夜交替信號的調節，說明TOC1在植物適應外界環境變化中發揮著至關重要的作用。

4 結論

本研究克隆獲得了高羊茅生物鐘基因FeTOC1，該基因編碼的蛋白質FeTOC1包含APRR家族保守的PR結構域和CCT結構域，且主要定位在細胞核中。在長、短日照下，高羊茅葉片中FeTOC1表達具有一定的晝夜節律性，但表達相位不受日照長度變化的影響，保持了晚間積累性表達的特性；持續光照顯著抑制了FeTOC1表達的振蕩節律，而持續黑暗下FeTOC1基因依然維持其表達水平和晝夜節律性，揭示了黑暗可能是啟動并維持該基因節律性表達的重要因素；顛倒晝夜節律后，相比于植物內在的生物鐘節律，FeTOC1基因優先響應外界晝夜交替信號。