虎杖苷十一碳烯酸酯的酶法合成與動力學研究

刁怡涵 李明依 畢艷紅 杜文迎 楊榮玲 王朝宇

(淮陰工學院生命科學與食品工程學院, 江蘇 淮安 223003)

黃酮苷類化合物是自然界中普遍存在的一類植物多酚代謝產物，具有獨特的化學結構及生物和藥理活性[1-2]。在保持該類化合物基本骨架結構的基礎上，對某些官能團進行化學修飾是當前天然產物類新藥開發的重要手段之一[3]。天然產物化學家David J. Newman分析了34年來FDA(Food and Drug Administration)批準上市的1 562種天然產物類藥物，發現46%的藥物是攜帶有天然藥效基團的衍生物或者類似物[4]。

虎杖苷(Ploydatin)是中藥材虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt)的主要藥效成分，具有改善心肌損傷、抗動脈硬化、抗癌以及免疫調節等多種藥理活性[5-6]。然而，虎杖苷的多羥基結構導致其在脂質體系中存在生物利用度低、溶解度差及結構不穩定等缺陷，限制了其在功能性食品、藥品及化妝品中的工業化應用[7]。將黃酮苷類化合物的分子結構進行適當修飾(如引入烷基鏈)，使其成為脂溶性藥物是解決上述問題的有效途徑[8]，如攜帶有不同結構烷基鏈的蘆丁、芒果苷、櫻桃苷和柚皮苷均表現出更優的生物活性[9-11]。此外，研究者還發現，含有雙鍵或苯環等功能性基團的烷基鏈與活性化合物的結合往往可以合成具有雙重功能的前導化合物，這為新藥的發現提供了思路[12-13]。

天然產物的化學法酰化修飾一般采用酰氯、酸酐等作為酰化試劑，還需要進行繁瑣的保護/去保護步驟，導致副反應多，污染環境[14-15]。與化學法相比，酶法酰化修飾具有選擇性高、減少雙鍵異構化及產物組成簡單等優勢，酶法酰化修飾已逐漸成為天然產物酰化修飾的主流方法[16-17]。本研究擬采用酶催化的方式，將虎杖苷與具有抗真菌抗病毒藥效的十一碳烯酸連接以制備具有潛在藥用價值的虎杖苷十一烯酸酯雙前藥(圖1)，并對酶促合成過程的動力學行為進行詳細研究，以期為綠色酶催化合成技術改進傳統化學合成過程提供借鑒。

圖1 酶促虎杖苷與十一碳烯酸乙烯酯的酰化反應Fig.1 Enzymatic regioselective acylation of polydatin with vinyl undecenoate

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase，TLL，55 U·g-1)、固定化南極假絲酵母脂肪酶B(CandidaantarcticaB lipase，CAL-B，44 U·g-1)和固定化根霉脂肪酶(Rhizomucormiehelipase，RML，12.6 U·g-1)購于中國Novozymes公司；固定化洋蔥布克氏菌脂肪酶(Burkholderiacepacialipase，PSIM，12.4 U·g-1)購于日本Amano公司。虎杖苷(≥98%)和2-甲基四氫呋喃(2-MeTHF)(≥99%)購于中國Aladdin公司；十一碳烯酸乙烯酯(≥98%)購于上海TCI公司。乙腈和甲醇均為色譜純，購于廣東西隴化工公司。反應介質均需經4 ?分子篩脫水48 h后使用。

1.2 主要儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀、Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，美國Agilent Technologies公司；BrukerAVANCE Digital 400 MHz超導核磁共振譜儀，德國Bruker公司；B-491旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI Labortechnik公司；CT15RE臺式高速離心機，日本Hitachi Koki公司；FA2004B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司。

1.3 反應初速度、底物轉化率、區域選擇性的計算

反應初速度(V0)=(C0-Ct)/t，底物轉化率(C)=(C0-Ct)/C0×100%，區域選擇性6″-Regioselectivity=Cpi/Ctotal×100%。其中，C0和Ct分別代表反應前后虎杖苷的濃度，Cpi和Ctotal分別代表酰化產物和所有酰化產物的濃度之和。

1.4 不同脂肪酶對酰化反應的影響

取5個10 mL反應瓶，分別加入3 mL 2-MeTHF和0.03 mmol虎杖苷，0.21 mmol十一碳烯酸乙烯酯，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)，其中4個反應瓶分別加入2.75 U不同來源的脂肪酶(TLL、CAL-B、PSIM、RML)啟動反應，另一反應瓶不加脂肪酶作空白對照，定時取樣離心(10 000 r·min-1，4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.5 反應介質對酰化反應的影響

取4個10 mL反應瓶，分別加入3 mL不同溶劑(丙酮、2-甲基四氫呋喃、叔丁醇、四氫呋喃)和0.03 mmol虎杖苷，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)，分別加入0.21 mmol十一碳烯酸乙烯酯和2.75 U TLL啟動反應，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.6 底物摩爾比對酰化反應的影響

取6個10 mL反應瓶，分別加入3 mL丙酮和0.03 mmol虎杖苷，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)， 分別加入酰基供體(十一碳烯酸乙烯酯與虎杖苷摩爾比為3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1)和2.75 U TLL啟動反應，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.7 溫度對酰化反應的影響

取6個10 mL反應瓶，分別加入3 mL丙酮和0.03 mmol虎杖苷，分別置于不同反應溫度(35、40、45、50、55和60℃，轉速200 r·min-1)的恒溫振蕩器中，加入0.27 mmol十一碳烯酸乙烯酯和2.75 U TLL啟動反應，定時取樣離心(10 000 r·min-1，4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.8 酶促虎杖苷十一碳烯酰化反應的動力學研究

取24個10 mL反應瓶，分別加入3 mL 2-MeTHF、丙酮、四氫呋喃和叔丁醇和不同濃度虎杖苷(4、6、8、10、12、14和16 mmol·L-1)，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(50℃，200 r·min-1)，以9∶1的摩爾比加入酰基供體及2.75 U TLL啟動反應，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析，測定反應初速度(V0)，根據Hans-Woolf 曲線得Km和Vmax。其中，Km為米氏常數，Vmax為最大反應速率。

1.9 高效液相色譜分析與產物結構鑒定

高效液相色譜儀，檢測波長為305 nm，流速1.0 mL·min-1。虎杖苷及酯的保留時間分別為2.29和4.65 min。將1.7中的反應放大20倍，過濾除去酶，以石油醚(petroleum ether，PE)/乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)作為洗脫劑，進行快速柱層析，旋轉蒸發后得到虎杖苷十一碳烯酸酯，并進行核磁共振分析。

2 結果與分析

2.1 不同來源脂肪酶對虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響

以反應初速度、底物轉化率和6″-區域選擇性為衡量指標，研究了4種不同來源的固定化脂肪酶對酰化反應的影響。由表1可知，不同來源的酶在催化相同的酰化反應時表現出不同的催化特征，以來源于Thermomyceslanuginosus的固定化酶TLL的催化效果最佳，反應初速度和底物轉化率分別達13.9 mmol·L-1·h-1和71.6%；其次是CAL-B，但其初速度僅為TLL的50.4%，為7.0 mmol·L-1·h-1。 就PSIM和RML而言，較低的反應初速度和底物轉化率均表明二者的催化活性較低，特別是RML的底物轉化率僅為16.4%。同時，經核磁共振分析產物結構可知，所用酶的催化位點均為虎杖苷分子結構中的6″-OH，表現出了優異的區域選擇性(100%)。

表1 不同來源脂肪酶催化虎杖苷十一碳烯酰化反應Table 1 Regioselective undecenoylation of polydatin catalyzed by various lipases

2.2 反應介質對酶促虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響

由表2可知，TLL在4種溶劑中均能催化虎杖苷的酰化反應，尤其以丙酮中最好，反應初速度為17.3 mmol·L-1·h-1，底物轉化率亦高達86.0%。其次為2-MeTHF，效果較差的為叔丁醇和THF溶劑，不適宜作為本試驗中酰化反應的介質。由表2還可知，酶的催化行為與溶劑的LogP、粘度和溶解度無相關性。如LogP在非水相酶催化中是重要的溶劑參數指標[18]，但TLL在LogP值最低的丙酮和最高的2-MeTHF中均表現出了較好的催化活性。此外，TLL在粘度相近的2-MeTHF和THF中表現出較大的催化差異。雖然虎杖苷在THF中溶解度是在其他溶劑中溶解度的數倍，高達72.1 mmol·L-1，但在THF中反應初速度僅為2.3 mmol·L-1·h-1，底物轉化率僅為19.3%。由此可見，溶劑的多種性質與酶促反應活性并未呈現直接相關性，其對酶催化活性的影響是多方面的。

表2 反應介質對TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響Table 2 Effect of medium on enzymatic acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.3 底物摩爾比對酶促虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響

TLL介導的酰化反應中酰基供體的量會對反應有一定影響[17]。本研究將虎杖苷的濃度固定為10 mmol·L-1， 通過改變酰基供體的濃度來探究底物摩爾比對反應的影響。如圖2所示，當底物摩爾比介于3∶1 到9∶1 之間時，酶促反應初速度及底物轉化率隨摩爾比的增大而明顯提高。當摩爾比升至9∶1時，二者升高至18.8 mmol·L-1·h-1和99.0%，進一步升高底物摩爾比對反應的影響甚微。在所選擇的底物濃度范圍內，酶促反應的6″-區域選擇性始終保持在100%。表明在該酰化反應中存在水解反應，當酰基供體和底物摩爾比達到9∶1時反應初速度和轉化率達到峰值。

圖2 底物摩爾比對TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響Fig.2 Effect of the molar ratio on TLL-catalyzed acylation of polydatin

2.4 溫度對酶促虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響

由圖3可知，35℃時酶促反應初速度為16.0 mmol·L-1·h-1， 隨著溫度上升，反應初速度呈上升趨勢并在50℃時達到最大值20.8 mmol·L-1·h-1，因此50℃為反應的最適溫度。繼續升高溫度，反應速度迅速下降。本研究還發現，溫度的改變并未改變反應的最大底物轉化率和區域選擇性，始終保持在100%，顯示出TLL較好的溫度適應性。

圖3 溫度對TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反應的影響Fig.3 Effect of the temperature on TLL-catalyzed acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.5 TLL催化虎杖苷十一烯酰化反應的過程曲線

酶促反應的轉化率和區域選擇性隨反應時間變化的規律如圖4所示，在20～100 min時，底物轉化率從11.5%上升到了80.0%，于200 min時達到98.4%；240～280 min時，底物轉化率則始終趨近100%，之后底物轉化率逐漸降低，在500 min時降至85.6%。在研究的時間范圍內，酶促反應的產物始終是虎杖苷-6″-十一碳烯酸酯，顯示出穩定的區域選擇性。

圖4 TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反應的過程曲線Fig.4 Process curve of TLL-catalyzed acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.6 不同反應介質中的酶促反應的動力學研究

本研究利用米氏方程，并依據Hanes-Woolf曲線對酶促反應的動力學參數進行了研究(圖5)。在所考察的介質中，TLL在丙酮中的反應初速度最大，為68.9 mmol·L-1·h-1。而就米氏常數而言，丙酮中的Km值為24.7 mmol·L-1，遠低于2-MeTHF(28.9 mmol·L-1)、叔丁醇(29.3 mmol·L-1)及THF(41.9 mmol·L-1)中的相應值。催化效率(Vmax/Km)是衡量酶促反應是否具有工業化應用價值的重要標準，在丙酮中，該反應Vmax/Km值為2.79 h-1，是在2-MeTHF、叔丁醇和THF中的1.3～6.6倍。

圖5 在丙酮(A)，2-甲基四氫呋喃(B)，叔丁醇(C)，四氫呋喃(D)中虎杖苷濃度對酶促酰化反應的影響Fig.5 Effect of polydatin concentration on enzymatic acylation in acetone (A), 2-MeTHF (B), t-butanol (C), and THF (D) (Inset of Hanes-Woolf plot)

3 討論

酶的活性中心是影響酶促反應的核心要素[19-20]。Pleiss等[21]曾將脂肪酶的活性中心劃分成裂縫狀、煙囪狀和隧道狀等不同形狀；且研究發現不同形狀的酶活性中心會影響底物分子中的活性基團與酶活性中心催化基團的結合，進而導致出現不同催化行為[22]。黃酮苷類化合物具有羥基眾多、空間結構復雜的特點，不同位點的酰化往往會產生一系列具有不同藥理活性的衍生物。虎杖苷結構中糖基上6″-伯羥基相比于其他仲羥基具有更小的空間位阻和更高的催化活性，這可能有助于其進入裂縫狀的TLL活性中心，以親和、攻擊酰基-酶過度中間體。進而形成優勢產物6″-單酯[23-24]。同時，酰基供體采用乙烯酯能使該反應成為準不可逆反應，其副產物乙醛易與酶蛋白中賴氨酸的末端氨基形成Schiff′s堿，從而使酶失活[25]，但這種失活程度由酶中特定賴氨酸殘基的親核性決定，與脂肪酶的來源、分子量等性質有關，這也是不同脂肪酶表現出不同催化活性的原因之一。此外，Kuo等[26]還發現有些脂肪酶可高效催化苷元中的4′-OH以形成相應的酯，但是本研究并未發現4′-OH被酰化，猜想虎杖苷中具有的較大空間位阻的糖基是導致上述現象的原因。

反應介質的性質對酶催化行為有顯著影響[27-29]。如Laane等[18]認為酶在LogP>4的溶劑中表現出優異的催化活性，而在LogP<2的溶劑中幾乎沒有活性。但在本研究中，酶促反應與溶劑的LogP并無直接相關性，粘度和溶解度同樣如此。Yang等[30]研究發現，溶劑分子可占據酶的活性中心影響雙底物與活性中心的結合，而影響程度則取決于溶劑分子的類型以及空間構型。由此可見，溶劑的多種性質影響酶的催化行為。此外，溶劑的改變并未改變催化反應的區域選擇性，這主要歸因于底物分子的特殊結構。

TLL酶促虎杖苷酰化反應體系中存在產物酶促水解的副反應，增加底物摩爾比有助于反應向酯合成方向進行，且在摩爾比為9∶1時反應速度和底物轉化率達到峰值。溫度對酶促反應的影響主要涉及酶蛋白的熱失活及溶劑體系的熱改變[31]。如升高溫度可以賦予酶蛋白中化學鍵更高的能量，使其運動性增強，繼而帶來酶活性中心的結構變化，最終導致酶催化行為的改變。此外，升高溫度還會導致反應溶劑粘度下降，從而降低酶促反應的傳質阻力，提高反應速度。當反應時間超過280 min(圖4)，底物的最大轉化率略有降低，主要是由于隨著反應的進行，酶促6″-十一碳烯酸酯的水解逐漸占據優勢，導致產物減少。

非水相介質中酶促雙底物酰化反應大都符合乒乓反應機制。TLL在丙酮中的Km值最低，Vmax/Km值最大，表明在該溶劑中酶與底物的親和力更強，催化效率更高，這也與溶劑篩選的結果相一致(圖5)。此外，已有研究發現，CAL-B催化虎杖苷與山梨酸乙烯酯酰化時，CAL-B在2-MeTHF中展現出最佳的催化特性，表明相同介質中酶促反應的特征也會因酶源、底物的差異而不同，表明酶與溶劑的生物相容性會因反應的改變而不同[23]。

4 結論

本研究以TLL為催化劑建立了綠色、高效、高選擇性合成虎杖苷十一碳烯酸酯雙前藥的生物催化體系，考察了酶源、反應介質、底物摩爾比及溫度等對反應的影響，結果表明，反應介質是影響酶催化活性的重要因素，但其LogP值、粘度以及溶解度等性質參數卻與催化反應活性無直接相關性，表明溶劑對酶催化行為的影響是多方面的；進一步的動力學研究也表明酶的催化行為會因酶源、底物的改變而不同。本研究為黃酮苷類化合物的合成提供了新途徑，還為綠色生物催化體系改造傳統化學合成過程提供了借鑒。