抗菌肽在牙本質粘接劑中應用的研究進展

馮杉杉，金毅夫，陳 歡，侯妍妍，丁景瑜，朱 松

口腔粘接劑與牙體組織牢固的結合,是修復體發揮功能,保證粘接耐久性的前提[1]。在酸蝕-沖洗粘接過程中,牙本質粘接劑未能充分滲透脫礦牙本質基質層,實現對混合層底部脫礦的膠原纖維有效完整的包裹與保護,獲得理想質量的混合層[2]。牙本質粘接界面處無法形成長期有效的邊緣封閉，產生微滲漏,細菌進入后引起繼發齲,最終導致粘接失敗。

目前通過采用濕粘接[3]、添加膠原纖維交聯劑[4]等減少粘接界面降解的方法使牙本質即刻粘接強度有了很大的提升,但這些方法仍然無法消除混合層的固有缺陷。為提高牙本質-樹脂界面的穩定性,具備抗齲功能的牙本質粘接劑成為研究的熱點。陽離子抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作為廣譜高效抗菌活性多肽,可以干擾致齲菌在生物膜中的粘附和定植，破壞生物膜的完整性，其獨特的抗菌機制和潛在的低誘導細菌耐藥性[5]使其在改性牙本質粘接劑中具有良好的應用前景。本文將從AMPs的種類、抗菌機制、在牙本質粘接劑中的應用及防齲效果等方面展開介紹。

1 AMPs的抗菌作用機制

氯己定、季銨鹽、三氯生等可以有效抑制致齲菌并控制菌斑生物膜的形成[6-8],長期應用可能會使致齲菌耐藥,破壞口腔的穩態,引起微生態失調, 難以提供長期有效的抗菌性，并對口腔健康造成不利影響[9]。AMPs，尤其是陽離子兩親性α-螺旋肽，能夠有效地抑制浮游細菌的生長和菌斑生物膜的形成，在誘導現有的生物膜溶解方面具有較高的生物活性[10]。

AMPs經典的非特異性作用機制可以概括為細胞膜靶向機制和非膜靶向機制[11-12]。前者AMPs通過初始的靜電作用和(或)疏水作用在細菌細胞膜上聚集,達到一定的閾值濃度后在其表面進行自組裝,破壞細胞膜的穩定性,形成跨膜孔道,導致細胞質泄漏、膜電位的去極化和膜功能障礙,最終使細胞裂解死亡[10,13-14]。后者AMPs可以穿過細胞質膜與細胞內靶點作用,通過抑制DNA、RNA的合成,干擾蛋白質的翻譯和阻礙細胞壁的合成等途徑殺滅細菌[15]。

2 AMPs在改性牙本質粘接劑中的應用

AMPs主要通過物理混合吸附或者化學共價結合的方法與牙本質粘接劑結合,并借非特異性靶向作用機制殺滅細菌。根據AMPs的功能可以將改性的牙本質粘接劑分為抗菌牙本質粘接劑和兼具抗菌和促礦化效果的雙功能牙本質粘接劑。

2.1 抗菌牙本質粘接劑

天然的AMPs結構-功能的結構關系復雜,AMPs抗菌性能具有不穩定性，因此無毒、高效、穩定的AMPs是目前臨床迫切需要的。為進一步優化其物理化學性能和抗菌性能,學者們合成天然AMPs的類似物或部分片段,并通過修飾氨基酸序列以提高AMPs的生物活性,優化合成肽的功能[16]。目前有研究顯示單一賴氨酸、Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽LR-10和LN-7、乳酸鏈球菌素(Nisin)和GH12等已開始用于改性牙本質粘接劑。

2.1.1 Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽 Reuricin-6和Gassericin A是由口腔中乳桿菌分泌的環狀細菌素,能有效抑制變異鏈球菌的生長及其生物膜的形成[17]。因其具有較長的環狀結構,合成復雜且成本較高，有研究從Reuricin 6或Gassericin A的陽離子α-螺旋區域截斷的LR-1(ATGTARKLLDAMA-NH2),構建了10種新的具備陽離子性和疏水性的短線增強AMPs[18-19]。實驗結果顯示,LR-10(LRWWLWKLLRRMR-NH2)在抑制生物膜的生長和對變異鏈球菌殺菌效果方面呈劑量和時間依賴性、對口腔生理條件的耐受性強、生物安全性高[19]。

此外,有學者指出,AMPs螺旋成分的百分比>80%,對其抗菌性能有影響[20]。對此,有研究者對LR-1進行氨基酸替換和結構修飾合成LN-7(LRRWLRWLLRWMR-NH2),通過圓二色譜分析測定,LN-7中α-螺旋結構的比例為99.6%,并結合抗菌實驗驗證具有高螺旋組成LN-7具備良好的抗菌活性[19]。將STAMP中靶向變異鏈球菌的功能結構域與LN-7、LR-10整合[21],并將整合后的AMPs物理混合到牙本質粘接劑中[10]，以提高其對致齲菌細胞膜的靶向選擇性。

2.1.2 抗菌肽GH12 GH12(GLLWHLLHHLLH-NH2) 是一種兩親性陽離子AMPs，具有高比例的α-螺旋結構和平衡的參數結構[22]。體內和體外實驗研究都表明GH12在唾液中保持穩定，具有快速和強大的抗菌活性，此外，GH12具有濃度依賴性，64 mg/L的GH12處理后的生物膜呈現松散、平坦和多孔樣形態，可顯著破壞生物膜的形態和結構的完整性[22]。研究發現GH12具有智能酸活化防齲的能力，酸性pH不影響GH12的二級結構，促進GH12在陰離子細菌膜上的累積，增強與細菌膜的相互作用，誘導生物膜基質降解，提升對細菌的殺傷力[23-24]。當口腔中致齲病原菌生長積累,pH下降時,被組氨酸修飾的GH12可以增強細菌細胞膜的通透性和胞膜的溶解活性[24-25],有選擇地殺死預先定植在牙菌斑中的致齲菌,抑制各種毒力因子作用,調節致齲條件下牙菌斑中的不良微生物生態環境[22,26-27],降低齲齒的發生率。

GH12及其衍生物可與牙本質粘接劑Single Bond 2共聚結合[28]。但AMPs存在有限的最佳活性構象, AMPs與聚合物之間的非特異性相互作用會限制肽的生物活性, 降低AMPs的抗菌性能[29]。粘接劑中的AMPs固化后會失去部分活性，學者在AMPs上設計間隔域,提供靈活性構象, 使抗菌肽在與粘接劑共聚結合后仍可發揮最佳抗菌生物活性[30-31]，保證粘接劑的遠期抑菌效果。添加單一賴氨酸還可以調節粘接劑的酸堿度,克服粘接界面處酸性微環境的不利影響,提高粘接的耐久性[32]。有研究者嘗試將ε-聚賴氨酸添加到牙本質粘接系統中與共聚單體偶聯,并依據ε-聚賴氨酸中α-NH2可以與共聚物中的—COOH反應形成多肽單體的原理,設計出GH12,GH12-M1(K_GGGSG_GLLWHLLHHLLH)和GH12-M2(GLLWHLLHHLLH_GSGGG_K)3種多肽單體進行對照實驗研究,其中GH12-M1包括一個間隔域,在N端有一個單一的賴氨酸殘基,用于偶聯到聚合物上,GH12-M2具有與GH12-M1相同間隔區序列,但是將單一的賴氨酸殘基放置在肽的C—末端,最終實驗證實GH12-M2具有更優異的抗菌功效和靈活性,可以直接地偶聯到粘接劑配方中[29]。目前尚未開發出與牙本質粘接劑結合的理想的共聚單體——不降低AMPs的生物活性和保持牙本質粘接劑所需的性能[33],但利用AMPs對復雜牙菌斑生物膜的有效作用機制,探索如何維持AMPs的抗菌調控機制的長期敏感性是十分有必要的。

2.1.3 乳酸鏈球菌素(Nisin) Nisin是一種由乳酸鏈球菌產生的具有高效的抗菌活性小分子多肽，其抗菌活性不受唾液中的酶、蛋白質或其他無機成分的影響[34]。在低pH環境中，Nisin的穩定性更高，在粘接界面溶解吸附能力增強，其對致齲菌的抑制作用更明顯[35]。

體外實驗研究顯示在光固化的牙本質粘接劑中Nisin能長期存在于粘接界面，抑制變異鏈球菌的生長，且隨著Nisin濃度的增加，抑制作用增強[36]。在自酸蝕和酸蝕-沖洗模式下，1%～3%Nisin都不會對Single Bond Universal粘接強度產生不利影響，其中含有3%Nisin粘接劑對變異鏈球菌單種生物膜和唾液衍生多物種生物膜的生長的抑菌效果最好[36-37]。

盡管粘接劑中Nisin可以抑制多種細菌的共聚，但是還需要對繼發齲動物模型進行體內研究及體外實驗，進一步研究粘接劑固化后影響Nisin活性的因素，以提升Nisin抗菌敏感性和穩定性。

2.2 雙功能牙本質粘接劑

齲損是牙體硬組織脫礦和再礦化之間動態失衡造成的，具備再礦化功能的AMPs可以充當異質成核位點,或通過與晶體表面相互作用在粘接界面處作為模板,形成晶體的成核和成長過程[38]。粘接劑中的AMPs可以促進存在缺陷的混合層再礦化,提高粘接界面的封閉性和完整性，優化粘接界面處的即刻和遠期修復效果。

據報道,磷蛋白和磷酸肽能促進礦化,磷酸絲氨酸(phosphoserine,Sp)是其中的關鍵部分,它與羥基磷灰石(HA)結合,并吸引游離鈣離子(Ca2+)作為核心啟動礦化[39-40]。Zhou等[41]在能夠殺死包括變異鏈球菌在內的多種細菌和真菌的唾液抗菌肽Histatin 5(H5)的N-端枝接了Sp,構建了具有生物活性的Sp-H5分子,使其成為一種兼備抗菌和再礦化性能的生物活性抗菌肽,可安全用于齲齒的預防和有效促進齲損原位自愈。

有研究顯示，不同序列和空間構象、兩親性、陽離子性、極性角等會賦予AMPs不同的抗菌效果[44]。因此AMPs的抗菌性能不僅取決于較強的α-螺旋構象，還取決于適當的疏水性和陽離子平衡和最佳的兩親性結構。

3 總結與展望

盡管近年來AMPs改性的牙本質粘接劑已經取得一定的進展，粘接界面處的邊緣封閉性增強抗菌效果顯著提升，適當添加AMPs對于粘接劑的遠期粘接效果和機械性能影響較小。但是AMPs在牙本質粘接劑中的應用仍然存在一些問題,如需進一步評估AMPs的生物分子特征和功能特性的關系，調整AMPs的結構和功能，降低其細胞毒性，抑制致齲生物群的生長，優化抗菌性能；明確AMPs與牙本質粘接劑構建過程的復雜機制及需添加AMPs的安全有效濃度；研究證明二者結合的穩定性以及一些添加抗菌肽的粘接劑對宿主細胞是否可能引起不必要的促炎反應等。

陽離子抗菌肽的化學和物理穩定性很可能會受到外界因素的影響，如溫度和pH，從而縮短抗菌活性的時間。如何調整AMPs的濃度，協調固化后的粘接劑穩定持久的抗菌活性、粘接的耐久性和粘接強度之間的平衡狀態,保證材料的機械性能，切實提升粘接修復的遠期效果，也是未來我們需要不斷努力和探索的方向。