結核特異性抗原與CD4+ T細胞計數比值對AIDS合并肺結核的輔助診斷價值

張黎娟 張華 王霞芳 施美華 馮彥軍 張建平 唐佩軍

AIDS與肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)均是病亡率較高的傳染性疾病[1]，二者相互影響，病情復雜[2]。目前，診斷結核病主要通過涂片法和分離培養法，但涂片法敏感度較低，陽性率僅為30%～50%，較易漏診；分離培養法雖敏感度較高，但培養周期長，二者臨床應用均受到一定限制。近年來，γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)被廣泛應用于結核感染檢測中[3]，并在結核病低發病率地區具有較高的檢測敏感度和特異度。然而，IGRA檢測結果會受到機體免疫狀態的影響，與CD4+T淋巴細胞(簡稱“CD4”)密切相關，極易降低其對HIV感染合并PTB患者的檢測敏感度[4]。而結核特異性抗原(TBAg)在嚴重免疫缺陷患者中的表達較高，且合并PTB患者的TBAg/CD4是未合并PTB患者的18.6倍[5]，有助于提高晚期HIV感染合并PTB患者的診斷準確性[6]。但考慮IGRA檢測在不同種族、國家或地區存在較大差異，TBAg和TBAg/CD4的診斷價值需在我國進一步驗證。為此，筆者通過評價全血IGRA檢測中抗原濃度、TBAg及TBAg/CD4水平，首次探討其對我國AIDS合并PTB患者的早期診斷價值。

對象和方法

一、研究對象

采用前瞻性研究的方法，參照入組標準納入2018年1月1日至2020年12月31日蘇州市第五人民醫院收治的262例疑似PTB的AIDS患者。根據最終是否合并活動性PTB，將患者分為AIDS+PTB組和AIDS組。前者共計152例，男性143例(94.08%)、女性9例(5.92%)，年齡范圍為23～86歲，平均年齡為(46.36±16.55)歲；后者共計110例，男性100例(90.90%)、女性10例(9.09%)，年齡范圍為20～82歲，平均年齡為(45.54±12.99)歲。兩組患者性別分布和年齡差異均無統計學意義(χ2=2.175，P>0.05；t=0.654，P>0.05)。本研究通過蘇州市第五人民醫院倫理委員會批準，并取得所有患者知情同意。

納入標準：(1)年齡>18歲；(2)自愿參加并簽署知情同意書；(3)AIDS均經蛋白免疫印跡試驗確診[7]；(4)活動性PTB依據《WS 288—2017肺結核診斷》[8]標準診斷。排除標準：(1)肝功能損傷者；(2)血肌酐大于正常值上限1.5倍以上者；(3)精神障礙及嚴重神經官能癥者；(4)妊娠期、哺乳期婦女或準備受孕的育齡婦女；(5)對治療藥物產生嚴重不良反應者。

二、研究方法

1.資料收集：通過查閱電子病歷系統收集研究對象基線臨床資料，包括性別、年齡、出院診斷；采集患者入院次日清晨時肘正中靜脈血進行干擾素體外釋放酶聯免疫法(TB-IGRA)、血常規和CD4檢測；完善胸部CT檢查；行痰液或經支氣管鏡刷檢抗酸桿菌涂片染色、分枝桿菌和普通細菌培養；必要時行病理學活檢和診斷性抗結核及抗感染等治療。

2. TB-IGRA：檢測設備為Phomo酶標儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，檢測范圍為12.5～400 pg/ml。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)相關γ-干擾素(IFN-γ)檢測試劑盒由北京萬泰生物藥業股份有限公司研制。嚴格按照說明書操作，即采集患者靜脈血，肝素抗凝2 h內分別吸取1 ml置入本底對照培養管(N)、測試培養管(T)和陽性對照培養管(P)中，于37 ℃恒溫箱培養(22±2)h，全血離心10 min，吸取上清血漿至離心管進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。通過酶標儀測量每個微孔的吸光度(A)值，將測得的A值錄入QFT分析軟件進行計算，確定每份檢測血漿樣品的IFN-γ濃度。依次記錄本底對照培養管IFN-γ濃度(pg/ml，即N抗原濃度)、陽性對照培養管與本底對照培養管濃度差(P-N)、測試培養管與本底對照培養管抗原濃度差(T-N，即TBAg)。當N≤400 pg/ml，T-N≥14 pg/ml且≥N/4，即為TB-IGRA陽性；當N≤400 pg/ml、P-N≥20 pg/ml、T-N≤14 pg/ml且

3.CD4計數：采用美國BD公司的FACS Calibur流式細胞儀，熒光抗體為CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC，嚴格按照說明書操作。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行分析。計數資料以“百分率(%)”描述。偏態分布的計量資料以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)] ”描述，兩組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。以臨床診斷為參考標準，評價TB-IGRA檢測AIDS合并活動性PTB的效能；通過繪制受試者工作特征曲線(ROC)，計算曲線下面積(AUC)，以確定最佳診斷效能指標。

結 果

一、TB-IGRA對AIDS合并活動性PTB的診斷效能

AIDS+PTB組152例患者中，TB-IGRA檢測陽性率為53.95%(82例)；其中，55例病原學確診患者的檢測陽性率為69.09%(38/55)；97例臨床診斷患者的檢測陽性率為45.36%(44/97)。以臨床診斷為參考標準，TB-IGRA檢測AIDS合并活動性PTB的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率分別為53.95%、75.45%、75.23%、54.25%、62.98%。具體見表1。

表1 TB-IGRA以臨床診斷為參考標準檢測AIDS合并活動性肺結核的效能

二、TB-IGRA檢測N抗原濃度、TBAg及TBAg/CD4情況

結果顯示，TB-IGRA檢測AIDS+PTB組的N抗原濃度低于AIDS組，TBAg濃度、TBAg/CD4值均明顯高于AIDS組，差異均有統計學意義(表2)。

表2 N抗原濃度、TBAg濃度及TBAg/CD4水平在AIDS合并活動性肺結核及AIDS患者間的比較

三、ROC曲線分析TBAg/CD4值對AIDS合并活動性PTB的診斷價值

ROC曲線分析顯示，相較于AIDS組，N抗原濃度、TBAg濃度、TBAg/CD4值診斷AIDS合并活動性PTB的AUC分別為0.718、0.637和0.842。當TBAg/CD4的臨界值為0.592時，約登指數最大，其敏感度為88.10%，特異度為77.10%(表3，圖1)。

表3 各指標診斷AIDS合并活動性PTB的ROC曲線分析

圖1 對照培養管抗原濃度、TBAg濃度、TBAg/CD4值診斷AIDS合并活動性肺結核的受試者工作特征曲線

討 論

AIDS患者免疫功能低下，合并機會性感染的風險較高，MTB感染較為常見。研究表明，MTB感染可加速HIV感染者發展成AIDS患者的進程，而AIDS流行也成為全球結核病第三次回升的主要原因之一[1]，導致全球約1/3的AIDS患者最終死于結核病[9]。然而，目前的結核病檢測常用方法，如涂片法、培養法和免疫學方法等，均存在敏感度低、特異度差、耗時長等缺點，使得尋找高敏感度和特異度并適合臨床推廣的結核病早期檢測方法尤為重要。

目前，全血TB-IGRA檢測技術具有較好的敏感度和抗原特異度，在輔助結核病診斷方面具有較高的應用價值。本研究也發現，TB-IGRA檢測AIDS合并活動性PTB的敏感度為53.95%，對AIDS合并活動性PTB病原學確診患者的檢測敏感度為69.09%，與陳莉貞等[10]研究TB-IGRA檢測結果大于臨床參考值(>14 pg/ml)在AIDS與結核病共病患者中的敏感度(77.30%)大致相同，同時Huo和Peng[11]分析了2001年1月至 2015年10月發表在EMBASE、Cochrane和MEDLINE數據庫中比較TB-IGRA和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)準確性的研究，發現TB-IGRA對MTB/HIV雙重感染者的敏感度和特異度分別為69%和76%。分析原因可能為：我國是結核病高發國家，IGRA用于結核病檢測時，假陽性率較高[12]。其次，IGRA是基于患者特異性細胞免疫的一種試驗方法，而HIV感染者的CD4細胞免疫功能下降，影響IFN-γ的分泌。因此，外周血淋巴細胞的絕對值可能對檢測結果產生影響，尤其是CD4細胞較低者更易出現假陰性[13]。Druszczynska等[14]曾報道，既往感染MTB及長期暴露于MTB環境中均可導致TB-IGRA結果不完全可靠。另一方面，本研究TB-IGRA檢測的特異度為75.45%，高于Lu等[15]報道的65.80%，這可能與研究對象的年齡、性別、免疫狀態及病毒感染狀態有關，表現為隨著患者年齡的增大，其免疫力逐漸減退，抗酸桿菌涂片陽性的定量值和結核T細胞免疫反應也不斷增強[6]。另一項由985例結核病患者參與的國內研究發現，TB-IGRA檢測PTB的敏感度為88.4%，特異度為90.8%，其中明確診斷菌陽PTB的陽性率高達92.6%[16]，這可能與該研究樣本量較大、2/3的受試者年齡<50歲、1/3的受試者為明確診斷的菌陽PTB有關。

本研究首次驗證了TBAg/CD4對我國AIDS合并活動性PTB患者的早期診斷價值。相較于單純AIDS患者，TBAg、TBAg/CD4在AIDS+PTB組中明顯升高，N抗原濃度明顯降低，差異均有統計學意義。IGRA檢測中，N抗原濃度、TBAg水平可以反映患者感染MTB后，MTB相關特異性抗原激發IFN-γ的活化效應所產生的T淋巴細胞的數量，而CD4細胞則用來反映患者機體的免疫狀況，其數值的高低與機體釋放N抗原濃度、TBAg濃度的多少密切相關。故檢測TBAg/CD4比值的方法可以用來檢測TB-IGRA的診斷效能。進一步對N抗原濃度、TBAg濃度和TBAg/CD4進行ROC曲線分析發現，當TBAg/CD4臨界值為0.592時，其敏感度為88.10%，特異度為77.10%，約登指數最大，診斷效能最好。南非的一項研究采用T-SPOT.TB測量TBAg濃度，發現檢測TBAg/CD4的敏感度為76%，特異度為53%，提示聯合TBAg和CD4檢測明顯提高了T-SPOT.TB對MTB合并HIV雙重感染者的診斷準確度，且當TBAg/CD4>0.12時有助于提高活動性結核病的診斷效能[6]。筆者認為，雖然該研究與本研究使用的IGRA檢測方法不一致，但二者觀察指標基本一致；考慮南非的研究納入的研究對象均為培養陽性的PTB患者，故認為本研究中TBAg/CD4檢測的敏感度和特異度更高，對我國的AIDS合并活動性PTB患者的診斷價值更佳，可作為AIDS患者診斷活動性PTB的生物標志物之一。

綜上，相較于AIDS患者，AIDS合并PTB患者的TBAg和TBAg/CD4水平均明顯升高，尤以TBAg/CD4的輔助診斷價值高。臨床中，單純依靠TBAg易受患者免疫狀態干擾，不能避免漏診誤診；而TBAg/CD4值能降低這種免疫的影響，對AIDS合并PTB患者具有一定輔助診斷價值，但仍不能避免漏診，仍需尋找更有價值的早期診斷AIDS合并結核病的標記物和方法。