C型凝集素樣受體2與急性腦梗死病情程度及腦動脈狹窄的相關性研究

陳歌迪， 陶中海， 伏 兵， 譚 玉， 聶紅霞， 周 芳， 張照婷， 于善花， 曾慶宏

急性腦梗死目前是我國中老年人死亡和致殘的主要原因，降低人們的生存及生活質量[1]。而腦動脈粥樣硬化性狹窄是引起急性腦梗死的主要病因[2]，較早期識別血管狹窄及準確判斷患者的病情程度并采取針對性的治療措施，是改善預后的關鍵。為了評估發生急性腦血管事件患者的神經功能缺損程度，臨床上采用NIHSS量表[3],但存在評分偏向左側大腦半球等局限。CLEC-2作為血小板膜受體，與相應配體結合后，在血小板的活化與聚集[4]、激活炎癥反應等方面參與血栓形成[5～7]。有研究表明CLEC-2與缺血性疾病相關，而CLEC-2與急性腦梗死病情程度及腦動脈狹窄研究鮮有報道。對此我們進行了一項前瞻性研究，試圖闡明其相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象 前瞻性選取2020年6月-2021年7月在連云港市第二人民醫院神經內科首次發病住院的急性腦梗死患者，納入標準：(1)發病時間在2 w之內；(2)符合中華醫學會急性腦梗死診斷指南2010診斷標準；(3)經MRI明確診斷；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)既往口服過抗血小板及抗凝藥物等；(2)既往有卒中病史者；(3)出血性卒中或心源性栓塞；(4)動靜脈血管畸形、煙霧病、大動脈炎、動脈夾層分離、高凝狀態、術后狹窄引起的缺血性卒中；(5)有明顯感染或存在嚴重臟器功能不全、惡性腫瘤、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心功能不全者。該研究獲得本院倫理委員會的審批，所有患者知情同意。并設同期本院105例健康體檢者為對照組。

1.2 資料收集 詳細記錄所有患者以下資料：(1)年齡、性別、BMI指數等一般人口學資料；(2)吸煙、飲酒史；(3)既往糖尿病、高血壓病病史；(4)入院收縮壓、舒張壓；(5)實驗室檢查：血糖(隨機、空腹)、糖化血紅蛋白、高同型半胱氨酸血癥、甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、纖維蛋白原、尿酸；(6)臨床資料：NIHSS評分。

1.3 分組方法 根據入院時NIHSS評分評估病情，并分為3個亞組：輕度組NIHSS<6分，中度組6分≤NIHSS≤13分，重度組NIHSS≥14分。每位患者均行MRA檢查，由2位以上經驗豐富的醫師判斷MRA結果后分為，腦動脈狹窄組：MRA顯示管腔節段性變細甚至缺失(見圖1)；無腦動脈狹窄組：為血管腔光滑，直徑均勻一致(見圖2)。

圖1 右側頸內動脈閉塞

圖2 無腦動脈狹窄

1.4 血漿CLEC-2的測定 入組患者入院當天采集靜脈血2～5 ml收集在含有檸檬酸鈉作為抗凝劑的試管中，并以3000 rpm離心10 min后，將上清液存放于EP管中，統一保存到-80 ℃冰箱中，血漿標本于同一批次送檢,采用 ELISA雙抗體夾心法按照操作說明測定CLEC-2濃度，并對血漿CLEC-2濃度進行一式兩份定量檢測。

2 結 果

2.1 血漿CLEC-2水平與急性腦梗死病情嚴重程度的關系 共納入急性腦梗死患者211例，其中男131例(62.1%)，女80例(38.4%)，年齡(61.23±11.38)歲，血漿CLEC-2水平為(269.340±68.551)pg/ml，同期健康對照組105人，男62例(59.1%)，女43例(40.9%)，年齡(58.75±7.97)歲，CLEC-2水平為(172.980±21.012)pg/ml，前者CLEC-2水平明顯高于后者，差異有統計學意義(P<0.001)。按照入院時NIHSS評分把患者分為輕(128例，60.7%)、中(55例，26.1%)、重(28例，13.3%)3個亞組，CLEC-2水平分為(226.55±48.51)pg/ml、(323.23±28.72)pg/ml、(359.09±29.75)pg/ml，CLEC-2水平逐漸升高且3組之間兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2 腦動脈狹窄與無腦動脈狹窄兩亞組間基線資料比較 梗死組患者根據MRA結果分為腦動脈狹窄組(122例，57.820%)和無腦動脈狹窄組(89例，42.180%)。單變量分析顯示，腦動脈狹窄組年齡、BMI、吸煙史、入院收縮壓、入院血糖(隨機、空腹)、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白、纖維蛋白原、高半胱氨酸、入院NIHSS評分和CLEC-2濃度與非狹窄組存在顯著性差異(P<0.05)，可能為急性腦梗死患者合并腦動脈狹窄的危險因素(見表1)。

表1 狹窄組與無狹窄組危險因素的單變量分析

2.3 急性腦梗死患者腦動脈狹窄的多因素Logistic回歸分析結果 以存在腦動脈狹窄為應變量，上述各項危險因素為自變量進行的多因素Logistic回歸分析顯示，年齡(OR=1.078，95%CI1.032～1.126，P=0.001)、BMI(OR=1.453,95%CI1.122～1.881,P=0.005)、纖維蛋白原(OR=2.159，95%CI1.191～3.915，P=0.011)、CLEC-2濃度(OR=1.034，95%CI1.020～1.048，P<0.001)為ACI患者存在腦動脈狹窄的獨立危險因素。

2.4 CLEC-2預測急性腦梗死患者腦動脈狹窄ROC曲線分析結果 ROC曲線分析結果顯示，CLEC-2濃度預測急性腦梗死患者腦動脈狹窄的曲線下面積為0.862(95%CI0.812～0.912，P<0.001)；最佳截斷值為266.40 pg/ml，預測急性腦梗死患者腦動脈狹窄的敏感度為80.3%，特異度為80.9%(見圖3)。

圖3 入院時CLEC-2濃度預測急性腦梗死患者腦動脈狹窄的 受試者工作曲線

3 討 論

急性腦梗死為神經內科最常見的腦血管疾病，發病率正逐年增長。能早期準確判斷患者的病情程度并預測有無腦動脈狹窄，有效識別高危患者，并由此采取針對性的治療，將會使患者大大獲益。

CLEC-2為血小板Ⅱ型跨膜受體，屬于C型凝集素超家族的一員，包括跨膜區和胞質尾區，胞質尾區的YXXL結構對于信號轉導至關重要[8]。CLEC-2與內源性配體平足蛋白(podoplanin,PDPN)結合后可使酪氨酸激酶磷酸化，并激活磷脂酶γ2(PLCγ2)，最終使血小板聚集[9,10]。越來越多的研究報道了CLEC-2與血栓形成的密切相關，并維持血小板聚集體的穩定。Payne等使用下腔靜脈狹窄的小鼠模型進行實驗，人為補充缺失的CLEC-2后，引起血小板聚集，PDPN隨之表達增加，而應用抗PDPN抗體可使血栓減小，提示CLEC-2和PDPN的表達及相互作用引起血栓形成[11]。臨床研究發現，CLEC-2可在一定程度上反應血小板活化。費敏等人研究指出，血漿高CLEC-2水平是冠心病獨立危險因素[12]。張偉等研究報道，高CLEC-2水平較低CLEC-2水平發生卒中進展及不良預后的風險為7.69、4.58倍[13]。

本研究首次探討了CLEC-2與急性腦梗死早期神經功能缺損程度的相關性，表明血漿CLEC-2水平與急性腦梗死病情程度相關。當各種原因所致血管內皮損傷時，血小板被激活，引起血栓形成、管腔狹窄。如果腦組織缺血缺氧未及時得到改善，出現不可逆損傷，此時CLEC-2水平進一步增加，血小板活化及聚集反應會更加強化，可能導致腦動脈粥樣硬化進展及和持續的血栓栓塞癥狀，腦組織損傷進一步加重[14]。此外，CLEC-2還可以和單核細胞PDPN可以誘導炎癥反應，并通過調控巨噬細胞功能促使動脈粥樣硬化。另外一項研究發現，經過PDPN抗體處理后的大腦中動脈閉塞的小鼠，IL-18和IL-1β顯著降低，腦梗死的體積縮小，并改善神經缺損的癥狀，表明CLEC-2/PDPN軸通過促進炎癥反應在小鼠腦缺血性損傷中發揮著重要作用[5]，以上為CLEC-2與急性腦梗死病情程度相關的病理生理學機制。

腦動脈狹窄發生的主要病理生理過程就是動脈粥樣硬化及血栓的形成，是急性腦梗死的重要病因和明確的危險因素[15,16]，既往細胞及動物研究發現CLEC-2與動脈粥樣硬化密切相關，動物模型研究發現在晚期動脈粥樣硬化病變中發現了CLEC-2的配體PDPN，當動脈粥樣硬化的進展時，PDPN濃度增加，并進一步加重損傷[17]。而在早期的動脈粥樣病變，血管內皮損傷導致平滑肌細胞表達S100A13，引發血小板聚集，表明可能是獨立于PDPN的另一個CLEC2的潛在配體，S100A13和podoplanin的不同定位可能與其作用不同有關[18]。此外Furukoji等也發現，當動脈粥樣硬化發生時，平滑肌細胞和巨噬細胞和都可以表達血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)其誘導PDPN的過度表達并激活CLEC-2，導致血栓形成[19]。因此，本研究綜合選擇了腦梗死的常見危險因素并包括CLEC-2在內的多項生化指標，對梗死組腦動脈狹窄患者和無腦動脈狹窄患者進行比較，將有差異的變量納入多因素Logistic回歸分析后，表明腦動脈狹窄發生的獨立危險因素分別是年齡、BMI、纖維蛋白原、CLEC-2濃度，且狹窄組的風險是無狹窄組的1.078、1.453、2.159、1.034倍，雖然研究顯示糖尿病、低密度脂蛋白等分布差異不明顯，可能與患者為初次發病，發病年齡低，較多人處于糖尿病前期，病變處于動脈硬化早期階段，低密度脂蛋白較纖維蛋白原沉積并不顯著[20]。ROC曲線提示，CLEC-2水平高于266.40 pg/ml可能有較高的風險發生腦動脈狹窄。以上結果表明，CLEC-2可能反映了動脈粥樣硬化疾病中的血小板活化和斑塊易損性，提示CLEC-2及其配體是血小板、免疫細胞和靶細胞之間的分子橋梁，是炎癥和血栓形成之間的新型機制聯系。

總之，本研究結果提示血漿CLEC-2升高可作為急性腦梗死病情程度及有無血管狹窄的評估，但具體機制仍需進一步研究。未來找到CLEC-2及其配體在疾病診斷、治療和應用中的平衡具有十分重要的意義。本研究局限：(1)少量樣本研究有一定的選擇性偏倚；(2)我們只測定了入院時CLEC-2水平，不能揭示CLEC-2水平升高是腦血管疾病的結果還是致病因素,二者之間因果關系尚不能確定;(3)腦血管狹窄的危險因素并未完全納入,且血漿CLEC-2升高與大動脈狹窄的獨立關聯機制尚不清楚，上述的不足之處均可能對結果產生影響，因此應謹慎看待本研究結果，未來需要更大樣本、更加完善的設計方案來進一步證實。