脂質運載蛋白2在乳腺癌侵襲轉移中的作用機制

葉蕓，李彥姝，張紅艷，李豐

（中國醫科大學生命科學學院分子細胞生物學教研室，國家衛生健康委員會細胞生物學重點實驗室暨教育部醫學細胞生物學重點實驗室，沈陽 110122）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的惡性腫瘤［1］。雖然近半個世紀以來其綜合治療取得了重要進展，但每年仍約有30%以上的患者死于復發和轉移。乳腺癌的轉移是一個復雜的過程，涉及多種信號通路和分子［2］。因此，尋找和分析乳腺癌轉移的機制非常重要。

脂質運載蛋白2（lipocalin-2，LCN2）是lipocalin蛋白超家族的成員，是一種分泌的糖蛋白，可轉運小的親脂性配體。Lipocalin蛋白超家族顯示出有限的氨基酸序列相似性，但共有高度保守的3D結構。該結構由單個8鏈，反平行的β-桶組成，該桶形成一個封閉的結構，能夠靈活結合并允許脂環蛋白轉運和呈遞配體，與細胞表面受體結合并形成大分子復合物，從而在細胞調節、增殖和分化中執行各種重要功能［3］。在過去的二十年中，已經發現LCN2在多種器官的病理條件下異常表達，包括炎癥［4］，腎臟功能損害［5］，肝臟功能損害［6］和幾種人體器官腫瘤［7］。目前，LCN2作為人類癌癥的一個潛在生物標志物和調節劑而備受關注，成為預測腫瘤和腫瘤防治的研究熱點。本研究旨在探討LCN2在乳腺癌細胞和組織中的表達、定位，以及LCN2對于乳腺癌細胞侵襲轉移的影響，為后續研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與乳腺癌組織切片：人乳腺上皮細胞HBL100、人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1、ZR-75-30、MDAMB-231、T47D細胞購自中科院上海細胞所。10例人乳腺癌組織切片樣本來自中國醫科大學附屬第一醫院。

1.1.2 試劑：RIPA裂解液購自普利萊基因技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；GAPDH抗體購自上海康成生物工程有限公司；LCN2抗體、E-cadherin抗體、Claudin-1抗體和Slug抗體購自美國cell signaling生物公司；β-actin抗體、細胞培養基和血清購自上海life公司；ECL發光液購自美國Thermo Fisher公司；Alexa Fluor 488標記二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司；DAPI核染料購自美國Sigam公司；S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。Flag-LCN2過表達慢病毒購自上海吉凱公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：HBL100、T47D、ZR-75-30和ZR-75-1細胞系在RPMI-1640培養基中培養，MCF-7細胞系在含有0.01 mg/mL人胰島素的最低必需培養基（Eagle’s minimum essential medium，EMEM）中培養，MDA-MB-231細胞在L-15培養基中培養。培養基中含有10%胎牛血清和青鏈霉素等，培養條件為37℃、5%CO2，將細胞培養至對數生長期。

1.2.2 Western blotting：將乳腺癌細胞系常規培養至對數生長期，加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上放置20 min，裂解乳腺癌細胞。12 000g，4 ℃ 離心20 min，收集上清蛋白，取上清5 μL進行總蛋白定量。30 μg總蛋白經10% SDS-PAGE凝膠分離，4 ℃過夜恒壓轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜15 min×3次。分別用兔抗人LCN2抗體（1∶2 000稀釋），E-鈣黏連蛋白（E-cadherin）抗體，緊密連接蛋白（Claudin-1）抗體，波形蛋白（Vimentin）抗體以及鋅指轉錄因子（Slug）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜15 min×3次。再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠（1∶5 000稀釋）二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜15 min × 3 次。ECL顯色，壓片。GAPDH作為上樣量是否一致的內參。

1.2.3 免疫組織化學：10例乳腺癌組織切片經過脫蠟和水合后，進行高壓鍋抗原修復、山羊血清封閉。切片用稀釋的LCN2抗體（1∶200）在4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG常溫孵育2 h。DAB辣根過氧化物酶底物顯色。蘇木素染核后，組織切片脫水，中性樹膠封片。光學顯微鏡進行圖片采集。

1.2.4 激光共聚焦掃描顯微鏡：過表達LCN2的MCF-7細胞培養于蓋片上，去除培養基，用預冷PBS清洗2次。加入4%多聚甲醛常溫固定細胞10 min；加入0.1%的Triton X-100對細胞膜進行透化10 min，PBS清洗5 min×3次；山羊血清封閉30 min，棄掉封閉液；加入稀釋的LCN2抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次；加入Alexa Flour594標記的二抗（1∶200）室溫避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次；DAPI（1∶1 000）室溫避光孵育10 min，PBS洗5 min×3次。甘油封片，應用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察LCN2在MCF-7細胞中的定位。激發光波長分別為594 nm和340 nm，可看到LCN2蛋白在細胞內的定位處呈現紅色，DNA染色呈現藍色。

1.2.5 慢病毒感染細胞構建穩定過表達LCN2細胞系：利用LCN2過表達慢病毒感染MCF-7和T47D細胞系，并成功構建MCF-7/LCN2穩定表達細胞系以及T47D/LCN2穩定表達細胞系，感染步驟按照吉凱公司慢病毒說明書進行，感染24 h后，換成正常培養基培養，3 d后，2 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性細胞，收集細胞提取蛋白進行Western blotting 檢測。Western blotting 數據結果利用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.2.6 Transwell遷移能力檢測：24孔板中每孔加入500 μL含血清培養基，置入Transwell小室，對T47DCON細胞和T47D-LCN2細胞分別進行細胞計數后，于小室中各加入20 000個細胞（不含血清的培養基），孵箱培養18 h，取出小室，鏡下觀察有細胞穿過，終止。95%乙醇固定，結晶紫染色，鏡下拍照。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism v6.0和SPSS 17.0軟件對各組細胞中蛋白灰度值進行Student’st檢驗（雙側）分析差異表達。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LCN2在乳腺癌細胞系中的表達

結果顯示，LCN2在HBL100細胞系中幾乎不表達，在ZR-75-1細胞系和MDA-MB-231細胞系中高表達，β-actin為內參對照，見圖1。

圖1 LCN2在正常人乳腺上皮細胞及不同乳腺癌細胞系中的表達Fig.1 The expression of LCN2 protein in normal mammary epithelial cells and different human breast cancer cell lines

2.2 LCN2在乳腺癌組織中的定位

免疫組織化學檢測LCN2在乳腺腫瘤組織切片中的表達，以蘇木素染細胞核。結果顯示，LCN2主要表達于乳腺癌組織細胞質中（圖2），圖2A展示LCN2低表達，圖2C展示LCN2高表達，圖2B和圖2D分別是圖2A和圖2C放大后的圖像。

圖2 LCN2主要表達于乳腺癌組織的細胞質內Fig.2 LCN2 protein was localized mainly in the cytoplasm of breast cancer cells

2.3 LCN2在乳腺癌MCF-7/LCN2細胞系中的定位

利用LCN2過表達慢病毒感染MCF-7細胞系，并成功構建MCF-7/LCN2穩定表達細胞系。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察LCN2蛋白為紅色，細胞核為藍色，兩圖疊加顯示為完整圖像。結果顯示，紅色的LCN2蛋白主要定位于細胞質中，見圖3。

圖3 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察LCN2在MCF-7/LCN2細胞內的定位 ×600Fig.3 The localization of LCN2 was determined by laser scanning confocal microscopy ×600

2.4 LCN2促進乳腺癌細胞的侵襲轉移

采用Flag標簽的LCN2過表達慢病毒感染T47D細胞，構建穩定表達LCN2的T47D細胞系。Western blotting驗證成功構建了過表達LCN2的乳腺癌T47D細胞系（圖4A）。本研究檢測了E-cadherin，Claudin-1，Vimentin和Slug等與上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）發生相關的標志物，結果顯示，E-cadherin和Claudin-1蛋白表達明顯降低（圖4B、4D），而Slug以及Vimentin表達明顯增高，GAPDH為內參對照（圖4C、4E）。

圖4 蛋白印跡法檢測過表達LCN2的人乳腺癌細胞T47D中的E-cadherin和Claudin-1、Vimentin、Slug的蛋白表達Fig.4 Western blotting analysis shows the protein level of Claudin-1，E-cadherin，Vimentin，and Slug in human T47D breast cancer cells overexpressing LCN2

2.5 LCN2促進乳腺癌細胞的遷移

Transwell實驗結果顯示，與對照組T47D-CON組相比，穩定表達LCN2的T47D細胞的遷移能力增強，見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測過表達LCN2的人乳腺癌細胞T47D的遷移Fig.5 The migration of human T47D breast cancer cells overexpressing LCN2 is detected by Transwell

3 討論

LCN2是一種分泌的糖蛋白，在大多數人體組織中呈低水平表達，但在侵襲性腫瘤亞型中含量很高，包括乳腺癌，胰腺癌，甲狀腺癌，卵巢癌，結腸癌和膽管癌。高水平的LCN2與細胞增殖，血管生成，細胞侵襲和轉移有關，解釋和支持LCN2致癌和轉移潛能的機制包括多種信號途徑的激活［8］。因此，LCN2已成為對抗多種癌癥的潛在治療靶標。

本研究檢測了LCN2在不同分子亞型乳腺癌細胞系中的表達水平，結果顯示，LCN2在不同乳腺癌細胞系中表達水平不同，這提示LCN2表達水平或許與乳腺癌的分子分型相關［9］。據此，本研究選擇低表達LCN2的MCF-7及T47D細胞構建MCF-7/LCN2穩定表達細胞系以及T47D/LCN2穩定表達細胞系，為后續研究打下基礎。值得注意的是，在癌癥中，EMT與侵襲性細胞的產生和癌癥干細胞特性的獲得有關，是腫瘤細胞獲得轉移特征的潛在機制［10-11］，且 JIN等［12］的研究結果顯示，LCN2衍生的環狀RNA（hsa_circ_0088732）抑制膠質瘤中的細胞凋亡并促進EMT。另有研究［13］報道，在前列腺腫瘤中CXCL1-LCN2軸激活Src信號傳導觸發EMT，從而促進前列腺癌細胞的遷移，導致腫瘤轉移增強。故本研究檢測了過表達LCN2的乳腺癌細胞系T47D中的E-cadherin，Claudin-1，Vimentin和Slug等 與EMT發 生相關的標志物的表達水平，結果顯示，LCN2可能通過誘發EMT促進乳腺癌細胞的侵襲轉移，為進一步研究LCN2在乳腺癌中侵襲轉移的機制打下基礎，后續本研究亦通過transwell實驗證實LCN2促進乳腺腫瘤細胞的遷移。另外，1項近期的有關乳腺癌的研究［14］分析了LCN2的表達和亞細胞定位與臨床病理因素和患者預后的關系，結果顯示，LCN2核表達的缺乏或減少與侵略行為的特征有關，這與本研究中免疫組織化學以及激光共聚焦掃描顯微鏡的研究結果相符，在乳腺腫瘤組織和細胞中，LCN2主要定位于細胞質。本研究為尋找LCN2誘發EMT進而促進乳腺癌細胞侵襲轉移的分子機制打下基礎。

總之，LCN2可能是乳腺腫瘤進展的一種非侵入性診斷和預后生物標記，使乳腺癌細胞中的LCN2沉默可以抑制腫瘤的進展，研究LCN2在乳腺腫瘤發生發展中的作用，揭示涉及到的信號通路和分子機制，對于預防和治療乳腺癌具有重要意義。本研究為今后探討LCN2促進乳腺癌侵襲轉移的分子機制提供了一定的理論根據，具體相關的作用通路及靶點還有待深入研究。